一組蛋白降解相關(guān)分子在肝癌進展中的作用研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 原發(fā)性肝癌是發(fā)生在肝細胞或肝內(nèi)膽管細胞的一種惡性程度高、進展快、預(yù)后差的惡性腫瘤，其發(fā)病率在惡性腫瘤中排名第六，死亡率居第三。全世界半數(shù)左右的肝癌病人集中在中國，嚴重危害我國人民的健康。
　　 近年來，通過高通量蛋白芯片和蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)，在新的肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)標志物的研究方面已經(jīng)有較大的進展。建立肝癌轉(zhuǎn)移的多分子預(yù)測模型，經(jīng)大量臨床標本進一步驗證，尤其是前瞻性規(guī)模化驗證和加速臨床應(yīng)用將是今后的主要趨

2、勢和研究重點，對改善預(yù)后具有非常重要的臨床意義。
　　 真核細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)主要有兩種降解途徑：泛素一蛋白酶體途徑和溶酶體途徑。其中，泛素-蛋白酶體途徑能夠高選擇性地降解那些細胞在應(yīng)激和非應(yīng)激條件下產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，對維持細胞正常生理功能具有十分重要的意義。近年研究發(fā)現(xiàn)，泛素化與去泛素化的改變和多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，惡性腫瘤多伴隨癌基因和抑癌基因產(chǎn)物的表達異常。
　　 基于上述研究背景，我們推測蛋白降解系統(tǒng)中的關(guān)鍵分子，可能

3、通過直接影響與某些癌基因表達相關(guān)的蛋白質(zhì)水平，在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，從而具有作為肝癌預(yù)后及治療靶標的價值。我們與美國的合作實驗室利用基因表達譜芯片檢測了70例肝癌患者癌和癌旁組織，通過統(tǒng)計分析，我們篩選出了一組與蛋白降解相關(guān)的在肝癌中異常表達的基因：PSMD4、UBD和CSTB，并計劃深入研究它們的生物學(xué)功能。
　　 PSMD4基因編碼的蛋白是人26S蛋白酶體非ATP酶調(diào)節(jié)亞基4(26S proteasomen on-

4、ATPase regulatory subunit 4)，該分子含有兩段15個氨基酸的泛素相互作用模序(UIM)，能夠選擇性結(jié)合泛素化蛋白，介導(dǎo)蛋白質(zhì)降解。已有研究報道，PSMD4異常表達與炎癥性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎等疾病相關(guān)，PSMD4在肝癌中的表達及生物學(xué)功能尚不十分清楚，與肝癌患者的預(yù)后關(guān)系也未見報道。國外科研機構(gòu)和本實驗室的前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與PSMD4同屬人26S蛋白酶體非ATP酶調(diào)節(jié)亞基的PSMD10,又稱癌基因p28GANK

5、，其編碼的蛋白Gankyrin與肝癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，PSMD4是否也像Gankyrin一樣在肝癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，兩者之間是否有類似之處，值得我們深入研究。
　　 泛素樣蛋白D(UbiquitinD，UBD)屬于泛素樣蛋白家族，能夠共價結(jié)合靶蛋白，使其經(jīng)蛋白酶體降解。UBD能夠通過降解IκBα，調(diào)節(jié)TNF-α或者LPS誘導(dǎo)的內(nèi)在免疫激活，并且可能參與了DC細胞的成熟過程，故以往研究局限于其在免疫系統(tǒng)中的作用。UBD在肝癌

6、中的表達情況及其在肝癌發(fā)展進程中的具體功能并不清楚，其與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系也未見報道。
　　 CystatinB簡稱CSTB，是半胱氨酸蛋白酶抑制劑超家族的一員，可以抑制包括半胱氨酸蛋白酶在內(nèi)的多種蛋白水解酶的活性。M.J.Lee等人利用基因芯片鑒定了248個基因在HCC和癌旁組織中的差異表達，運用Northernblot以及Real-timePCR證實，在45例HCC樣本中，有36例(80％)患者CSTB的水平在癌中明顯高于癌

7、旁。更為重要的是，血清中CSTB的水平在HCC患者中明顯高于非惡性慢性肝病患者。這些結(jié)果提示，CSTB聯(lián)合AFP可能作為更敏感的HCC分子診斷標志物。然而，CSTB在肝癌中的表達情況及在肝癌中的生物學(xué)作用尚不十分清楚，與肝癌患者預(yù)后也有待進一步研究。
　　 本課題旨在檢測PSMD4/UBD/CSTB在肝癌中的表達，研究其在肝癌細胞中的生物學(xué)作用，利用臨床隨訪資料分析PSMD4/UBD/CSTB在肝癌預(yù)后判斷中的應(yīng)用前景，探討其作

8、為治療靶點的可行性，為后續(xù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。
　　 研究方法：
　　 1.基因表達譜芯片篩選與確認待研基因；
　　 2.利用Real-timePCR和Westernblot分別檢測不同肝癌細胞系/肝癌病人中PSMD4/UBD/CSTB的mRNA水平和蛋白水平；運用免疫組織化學(xué)染色在人的組織切片和肝癌組織芯片中進一步驗證PSMD4/UBD/CSTB表達情況；
　　 3.對103例肝癌組織預(yù)后芯片行PSM

9、D4/UBD/CSTB免疫組化染色，并對染色情況進行評分，結(jié)合臨床病理預(yù)后資料，統(tǒng)計分析PSMD4/UBD/CSTB作為肝癌預(yù)后及治療靶標的價值；
　　 4.構(gòu)建過表達質(zhì)粒，包裝慢病毒，通過瞬時轉(zhuǎn)染實驗和建立穩(wěn)定細胞系，初步探討PSMD4/UBD/CSTB在肝癌細胞惡性生物學(xué)行為中的作用；
　　 具體包括：利用CCK8試劑測定細胞增殖情況；利用transwell檢測肝癌細胞遷移能力的變化；用Spheroid成球?qū)嶒灆z測肝

10、癌干細胞表型的變化；利用常規(guī)化療藥物5-氟尿嘧啶，用AnnexinVKit流式檢測細胞凋亡情況。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.本科室前期研究中利用基因表達譜芯片檢測了70例肝癌患者癌與癌旁組織中基因的表達差異，篩選出了三個在肝癌中異常表達的基因：PSMD4、UBD和CSTB；
　　 2.PSMD4/UBD/CSTB在肝癌臨床樣本中mRNA水平和蛋白水平的表達均是癌中高于癌旁；
　　 3.PSMD4/UBD

11、/CSTB在肝癌組織中的表達與肝癌病人的無瘤生存期和總體生存期有關(guān)，可以作為肝癌預(yù)后指標；
　　 4.PSMD4和UBD均能促進細胞增殖，并能顯著抑制細胞凋亡；而CSTB可能更多地影響細胞的增殖能力，對抑制凋亡不起作用；
　　 5.PSMD4促進肝癌細胞的自我更新能力和轉(zhuǎn)移潛能；
　　 6.PSMD4在正常組織中不表達或表達很低以及其在多種腫瘤中高表達，提示PSMD4在腫瘤治療中的應(yīng)用前景。
　　 結(jié)論：

12、
　　 本課題利用基因表達譜芯片篩選出一組在肝癌中異常表達的與蛋白質(zhì)降解相關(guān)的基因PSMD4/UBD/CSTB，高通量檢測PSMD4/UBD/CSTB在肝癌中的表達并利用大樣本驗證；聯(lián)系臨床隨訪資料分析PSMD4/UBD/CSTB作為肝癌預(yù)后靶標的價值，初步探討了PSMD4/UBD/CSTB在在肝癌細胞中的生物學(xué)作用，并將我們的研究重點錨定在與Gankyrin同屬人26S蛋白酶體非ATP酶調(diào)節(jié)亞基的PSMD4，深入研究PSMD4