雙孔鉀通道TREK-1在大鼠心臟和腦星形膠質(zhì)細胞中的表達及功能研究.pdf

1、雙孔鉀通道(Two-pore-domain potassium channels，K2P通道)自上世紀90年代中期被發(fā)現(xiàn)以來，已經(jīng)引起了廣泛的研究興趣，而TREK-1(TWIK-Related Kchannl-1)做為K2P家族中的一員，因其自身獨特的通道理化特性以及在體內(nèi)的廣泛分布，在近年來更是成為關(guān)注的焦點。TREK-1在大腦以及心臟等重要器官中有著較高水平的表達，由此推測TREK-1在維持正常生理功能中可能起著十分重要的作用。隨著

2、各種生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，TREK-1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的各種功能逐漸被揭示，但由于缺乏針對TREK-1的特異性的阻斷劑，其在心肌細胞以及在腦星形膠質(zhì)細胞中的具體功能還不明確。心肌肥厚引起的心律失常性猝死約占心肌肥厚死亡人數(shù)的三分之一，越來越多的實驗結(jié)果表明，與心肌肥厚慢性階段相關(guān)的最一致的電生理變化就是動作電位時程的延長，而TREK-1做為牽張激活的鉀通道和背景鉀通道在其中發(fā)揮的主要功能還不清楚。星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)非興奮性細胞，其對維

3、持神經(jīng)元活性正常至關(guān)重要，星形膠質(zhì)細胞的一些病理改變?nèi)缂毎[脹，自由脂肪酸升高，細胞內(nèi)酸中毒等都是TREK-1的易感因素，而TREK-1是否存在于星形膠質(zhì)細胞上還不明確。一些病理改變?nèi)缧募》屎衿陂gTREK-1的改變也還未見報道，TREK-1在星形膠質(zhì)細胞中的電生理特性也尚未得到確認。因此本研究中我們側(cè)重于正常條件下或是病理改變條件下大鼠心肌細胞和腦星形膠質(zhì)細胞中與TREK-1相關(guān)的表達和功能研究，為進一步闡明TREK-1在心臟和大腦中的

4、具體功能并尋找新的藥物作用靶點提供理論基礎(chǔ)。
　　 第一部分:大鼠心肌肥厚期間左心室內(nèi)膜TREK-1蛋白表達和電流的改變
　　 1.異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌肥厚模型
　　 采用大鼠連續(xù)頸背皮下注射異丙腎上腺素(5mg/kg)7天誘發(fā)左心室肥厚模型，結(jié)果顯示肥厚組大鼠心臟重量比對照組大鼠心臟重量增加44.9％;肥厚組大鼠心臟重量與體重比比對照組增加45.2％;肥厚組大鼠左心室壁厚度比對照組增加34.9％。以上結(jié)果

5、表明大鼠連續(xù)頸背皮下注射異丙腎上腺素(5mg/kg)7天可成功誘發(fā)出左心室肥厚。
　　 2大鼠心肌肥厚時左心室內(nèi)膜雙孔鉀通道TREK-1蛋白表達的變化
　　 采用蛋白免疫印跡雜交(western blot)的方法觀察心肌肥厚過程中大鼠左心室內(nèi)膜TREK-1蛋白表達的變化趨勢。結(jié)果顯示肥厚組大鼠左心室內(nèi)膜TREK-1的蛋白表達水平比對照組升高26.6％。以上結(jié)果提示心肌肥厚可以顯著上調(diào)大鼠心室肌內(nèi)膜細胞TREK-1的蛋白表

6、達水平。
　　 3心肌細胞TREK-1電流的確認
　　 3.1機械牽張（負壓）激活的大鼠心室肌細胞外向單通道電流
　　 通過抽吸連接到一個壓力計的注射器來誘發(fā)機械牽張。結(jié)果顯示，在inside-out記錄模式下不給予細胞任何壓力刺激時很少能記錄到外向單通道電流，但是給予細胞膜片-30 cmH2O的負壓刺激時，可記錄到明顯的外向單通道開放事件，而在撤除負壓刺激后，開放的單通道電流幾乎被完全逆轉(zhuǎn)。-30 cmH20激

7、活的外向單通道的平均開放概率約為0.064±0.01。以上結(jié)果表明負壓（機械牽張）可以激活心肌細胞上外向的單通道電流。
　　 3.2細胞內(nèi)酸化作用激活的大鼠心室肌細胞外向單通道電流
　　 觀察細胞內(nèi)酸化作用對心肌細胞外向單通道電流的影響，同時與CHO-TREK-1細胞內(nèi)的酸化作用作用進行對比。結(jié)果顯示，在inside-out記錄模式下當細胞外液的pH值為7.3時，在心肌細胞記錄不到明顯的通道開放而在CHO-TREK-1細

8、胞上可以記到明顯的外向單通道電流。但當細胞外液的pH值為6.8的時候，兩種細胞均可明顯記錄到外向單通道的開放;當細胞外液pH值為6.3的時候，兩種細胞上開放的通道數(shù)目進一步增加。細胞外液的pH值為6.8和6.3的時候心肌細胞上激活的外向單通道的平均開放開放概率分別為0.037±0.007和0.124±0.009;細胞外液的pH值為7.3、6.8和6.3的時候CHO-TREK-1上激活的外向單通道的平均開放概率分別為0.068±0.002

9、、0.133±0.017和0.225±0.022。以上結(jié)果表明細胞內(nèi)的酸化作用可以激活心肌細胞上外向的單通道電流，且這一趨勢與細胞內(nèi)酸化作用對CHO-TREK-1的激活作用一致。
　　 3.3花生四烯酸激活的大鼠心室肌細胞外向單通道電流
　　 觀察花生四烯酸對大鼠心肌細胞外向單通道電流的影響。在inside-out記錄模式下10μM花生四烯酸可激活心肌細胞外向單通道電流，而CHO-TREK-1不需要給予花生四烯酸處理即可

10、記錄到大量開放的外向單通道電流。以上結(jié)果表明可以花生四烯酸可以激活心肌細胞上外向的單通道電流。
　　 3.4心肌細胞TREK樣通道的單通道電導(dǎo)
　　 根據(jù)上述記錄的兩種細胞不同電位下單通道平均擬合電流的大小計算出兩種通道的平均單通道電導(dǎo)分別為123±7 pS(CHO-TREK-1)和113±17 pS(cardiomyocyte)，兩者之間無統(tǒng)計學(xué)差異。這里我們記錄到的心肌細胞TREK-1的單通道電導(dǎo)與文獻報道的TREK

11、-1單通道電導(dǎo)范圍基本吻合
　　 綜合上述四部分的實驗結(jié)果，我們記錄的外向單通道電流可以被負壓（機械牽張），細胞內(nèi)酸化作用以及花生四烯酸激活，而且單通道電導(dǎo)與CHO-TREK-1的單通道電導(dǎo)比較接近，由此可以證明我們在心肌細胞上所記錄到的外向單通道電流為心肌細胞TREK-1。
　　 4.L-NBP對CHO-TREK-1、正常心肌細胞以及肥厚心肌細胞TREK-1單通道開放概率的影響
　　 應(yīng)用inside-out記

12、錄技術(shù)觀察L-NBP對TREK-1的抑制作用。在inside-out記錄模式下CHO-TREK-1細胞中不需要給予任何處理即可記錄到大量開放的TREK-1通道，給予10μM L-NBP作用5分鐘后，通道活性被明顯抑制但不能完全被逆轉(zhuǎn)。在正常心肌細胞和肥厚心肌細胞中，0.18 mM的氯仿可激活爆發(fā)式的TREK-1通道開放，給予10μM L-NBP處理5分鐘后通道開放事件明顯減少，但仍不能完全被抑制。10μM L-NBP對CHO-TREK-

13、1，正常心肌細胞TREK-1和肥厚心肌細胞TREK-1的抑制率分別為48.5±8％，54.3±-3％和55.5±4％，三者之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異。上述結(jié)果表明，0.18 mM氯仿可以顯著激活心肌細胞TREK-1;10μM L-NBP對TREK-1有顯著的抑制作用，而且10μM L-NBP對三種細胞上TREK-1的抑制作用基本上一致。
　　 5.L-NBP對正常心肌和肥厚心肌外向電流的影響
　　 應(yīng)用全細胞記錄技術(shù)觀察TREK

14、-1相對特異性阻斷劑L-NBP對正常心肌和肥厚心肌外向電流的影響。以10μM L-NBP抑制的外向電流大小作為一個參數(shù)來衡量正常心肌和心肌肥厚TREK-1的差別。在阻斷心肌細胞幾種主要類型的鉀電流的前提下，在全細胞記錄模式下正常心肌細胞中10μM L-NBP作用5分鐘可將外向全細胞電流從10.21±3.02 pA/pF抑制為8.99±2.40 pA/pF，而在肥厚心肌細胞中10μML-NBP可將外向全細胞電流從7.43±1.72 pA/

15、pF抑制為5.73±1.75 pA/pF。肥厚心肌細胞10μM L-NBP抑制的外向電流大小1.70±0.4 pA/pF比正常心肌細胞10μML-NBP抑制的電流外向大小1.22±0.36pA/pF顯著升高。上述結(jié)果提示L-NBP對肥厚心肌細胞TREK-1電流的抑制率明顯高于正常心肌細胞。
　　 6.氯仿對正常心肌和肥厚心肌外向電流的作用
　　 應(yīng)用全細胞記錄技術(shù)觀察TREK-1特異性激活劑氯仿對正常心肌和肥厚心肌外向電

16、流的影響。以0.18 mM的氯仿激活的外向電流大小作為一個與10μM L-NBP抑制的外向電流大小完全相反的參數(shù)來衡量正常心肌和心肌肥厚TREK-1的差別。在阻斷心肌細胞幾種主要類型的鉀電流的前提下，在全細胞記錄模式下正常心肌細胞中0.18 mM氯仿作用5分鐘可將外向全細胞電流從6.47±2.13 pA/pF增加為8.89±2.38 pA/pF，而在肥厚心肌細胞中0.18 mM氯仿可將外向全細胞電流從6.04±1.57pA/pF增加為9

17、.47±2.16pA/pF。肥厚心肌0.18 mM氯仿誘發(fā)的外向電流大小3.43±0.7pA/pF比正常心肌0.18 mM氯仿誘發(fā)的電流大小2.42±0.5pA/pF顯著升高。上述結(jié)果提示氯仿對肥厚心肌細胞TREK-1電流的激活作用明顯高于正常心肌細胞。
　　 上面兩部分實驗結(jié)果均顯示肥厚心肌TREK-1電流與正常心肌TREK-1電流相比有增高的趨勢，這個結(jié)果與前面的TREK-1的蛋白表達結(jié)果一致。
　　 第二部分:大鼠

18、腦星形膠質(zhì)細胞TREK樣通道的電生理確認
　　 1.花生四烯酸和氯仿激活的TREK樣外向單通道
　　 觀察花生四烯酸和氯仿對星形膠質(zhì)細胞外向單通道電流的影響。結(jié)果顯示，在inside-out記錄模式下10μM花生四烯酸和0.2 M氯仿可顯著激活星形膠質(zhì)細胞外向單通道電流。10μM花生四烯酸和0.2 Mel氯仿激活的星形膠質(zhì)細胞外向單通道的平均開放概率分別為0.173±0.01和0.255±0.02。
　　 根據(jù)不

19、同電位下記錄的花生四烯酸或氯仿激活的單通道平均擬合電流大小計算出該通道的平均單通道電導(dǎo)為107±16 pS，與文獻報道的TREK-1單通道電導(dǎo)范圍基本吻合。上述結(jié)果表明星形膠質(zhì)細胞上存在可被花生四烯酸和氯仿激活的外向鉀通道，且該通道的電導(dǎo)與TREK-1比較接近。
　　 2.機械牽張的影響
　　 通過抽吸連接到一個壓力計的注射器來誘發(fā)機械牽張。結(jié)果顯示，在inside-out記錄模式下不給予細胞任何壓力刺激時很少能記錄到外

20、向的單通道電流，但是給予細胞膜片-30 cmH2O的負壓刺激時，可記錄到明顯的外向單通道開放事件，而在撤除負壓刺激后，開放的單通道電流幾乎被完全逆轉(zhuǎn)。-30 cmH20激活的外向單通道的平均開放概率約為0.142±0.02。以上結(jié)果表明負壓（機械牽張）可以激活星形膠質(zhì)細胞上外向的單通道電流。
　　 3.細胞內(nèi)酸化作用的影響
　　 觀察細胞內(nèi)酸化作用對星形膠質(zhì)細胞外向單通道電流的影響。結(jié)果顯示，在inside-out記錄模

21、式下當細胞外液的pH值為6.8的時候，可明顯記錄到外向單通道的開放;當細胞外液pH值為6.3的時候，星形膠質(zhì)細胞上開放的通道數(shù)目進一步增加。細胞內(nèi)的酸化作用可以呈pH值依賴性的增加外向通道的平均開放概率。在+60mV下細胞外液的pH值為6.8和6.3的時候星形膠質(zhì)細胞上激活的外向單通道的平均開放開放概率分別為0.064±0.01和0.176±0.01。以上結(jié)果表明細胞內(nèi)的酸化作用可以激活星形膠質(zhì)細胞上外向的單通道電流。
　　 綜