AD病相關(guān)金屬蛋白的結(jié)構(gòu)-性質(zhì)-功能研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)，又稱老年癡呆癥，是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性退行性疾病，其臨床表現(xiàn)為認(rèn)知能力下降、行為異常以及日常生活能力降低。AD最典型的病理特征為：腦組織內(nèi)出現(xiàn)大量老年斑(senile plaques，SP)、神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)、神經(jīng)元數(shù)量減少和顆?？张葑冃浴D的發(fā)病機理十分復(fù)雜，可能是多因素相互作用的結(jié)果。迄今為止，阿爾茨海默病的確切

2、的發(fā)病機理還是一個未解之謎。
　　早期科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)AD患者大腦呈現(xiàn)異常高的神經(jīng)營養(yǎng)活性。1989年Uchida指出這一現(xiàn)象是由于AD患者腦中缺乏能夠抑制神經(jīng)元生長的抑制因子，并且成功的從正常人腦中分離得到這一僅有68個氨基酸組成的蛋白。因其與哺乳動物金屬硫蛋白(metallothionein，MI)家族成員具有高度的同源性，所以將其命名為MT3(金屬硫蛋白Ⅲ)；而其在腦提取液存在的情況下能夠有效地抑制神經(jīng)元過度生長，因而也被

3、稱為人類神經(jīng)生長抑制因子(human neuronal growth inhibitory factor，hGIF)。研究發(fā)現(xiàn)，在hGIF中的兩個結(jié)構(gòu)域α與β之間的相互作用對其神經(jīng)生長抑制活性非常重要，但是對其具體的機理并不清楚。因此，本文中我們構(gòu)建了β(MT3)-β(MT3)突變體，△33-35突變體(hGIF中的33SCC35片段被截除形成的突變體)，單β-結(jié)構(gòu)域突變體，并使用紫外-可見光光譜、圓二光譜、pH滴定、EDTA和DTNB

4、反應(yīng)對其光譜學(xué)性質(zhì)和生化性質(zhì)進(jìn)行了表征。同時，利用神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)實驗對hGIF及其突變體的神經(jīng)生長抑制活性進(jìn)行了測定。實驗結(jié)果表明△33-35突變體中含有與β-結(jié)構(gòu)域類似M3S9金屬硫簇的α-結(jié)構(gòu)域并不表現(xiàn)出hGIFβ-結(jié)構(gòu)域相似生化與生理性質(zhì)，而是同hGIFα-結(jié)構(gòu)域在生化性質(zhì)和生理功能上更加相似。綜合生化性質(zhì)實驗及生理活性實驗結(jié)果來看，我們發(fā)現(xiàn)hGIFβ-結(jié)構(gòu)域中金屬硫簇的穩(wěn)定性和溶劑暴露程度對蛋白的生理活性具有決定性的影響，而且h

5、GIFα-結(jié)構(gòu)域中特異的一級序列對兩結(jié)構(gòu)域之間的相互作用也是至關(guān)重要的。我們推測有可能是兩結(jié)構(gòu)域中某些氨基酸殘基之間通過次級作用力相互作用而影響結(jié)構(gòu)域中金屬硫簇的穩(wěn)定性和溶劑暴露程度，從而達(dá)到調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域及蛋白的生理功能。
　　淀粉樣多肽Aβ(amyloidβpeptide)是老年癡呆癥患者腦中老年斑的主要組成成分，在AD的發(fā)病機理的研究中占據(jù)著中心地位，其與MT3、淀粉樣多肽前體蛋白(Amyioidβpeptide precurs

6、or protein，APP)及金屬離子在神經(jīng)細(xì)胞中的內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡是細(xì)胞發(fā)揮其正常功能的關(guān)鍵。除了淀粉樣多肽在腦中的聚集以外，AD的細(xì)胞病理學(xué)特征還包括神經(jīng)生長抑制因子在腦中含量的下調(diào)、血紅素代謝紊亂等。雖然科學(xué)家們已經(jīng)意識到GIF和血紅素能夠有效的抑制淀粉樣多肽的聚集，并且體外實驗表明化學(xué)合成的Aβ具有與血紅素結(jié)合后形成具有過氧化物酶活性復(fù)合物的特性，但是關(guān)于Aβ與血紅素相互作用的機理及生理意義的解釋目前尚處于比較模糊的階段。本文中我們

7、首次用原核表達(dá)體系獲得了不帶有任何多余氨基酸殘基的生物合成淀粉樣多肽Aβ1-40，同時對其與血紅素的結(jié)合及結(jié)合過程中多肽Aβ1-40二級結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行了監(jiān)測，測試了其復(fù)合物的相關(guān)生化性質(zhì)。并對淀粉樣多肽與血紅素形成的復(fù)合物在淀粉樣多肽與銅離子造成的細(xì)胞毒性中的作用進(jìn)行了測定。實驗結(jié)果表明血紅素之所以能抑制淀粉樣多肽的聚集是因淀粉樣多肽與血紅素結(jié)合后能保持穩(wěn)定的α-螺旋結(jié)構(gòu)；同時表明淀粉樣多肽對細(xì)胞造成損傷必然伴隨著其α-螺旋結(jié)構(gòu)向β-折

8、疊結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變。當(dāng)?shù)矸蹣佣嚯呐c金屬銅離子混合物中加入適量的血紅素后，Aβ與銅離子造成的細(xì)胞損傷有顯著的緩解。結(jié)合Aβ-血紅素能形成具有過氧化物酶活性的復(fù)合物這一生化特性考慮，可能是由于其特異的過氧化氫酶活性對細(xì)胞內(nèi)淀粉樣多肽和銅離子生成的過氧化氫能有效的催化分解，而減低下游由過氧化氫產(chǎn)生的活性氧自由基而起到保護(hù)細(xì)胞的作用。
　　最新研究發(fā)現(xiàn)通常APP被固定在細(xì)胞膜表面，當(dāng)神經(jīng)元缺乏生長因子后，APP被與AD相關(guān)的兩個蛋白酶切割，從而

9、引發(fā)了由DR6(death receptor 6)導(dǎo)致的細(xì)胞預(yù)凋亡。先前被人們忽略的N-端APP(N-APP)可能是導(dǎo)致AD的罪魁禍?zhǔn)?，有可能成為治療AD病的新靶點，因而治療AD病策略焦點可能從Aβ轉(zhuǎn)移到N-APP或者其下游合作者-控制凋亡的蛋白。本文中通過各種表達(dá)系統(tǒng)的嘗試，成功構(gòu)建表達(dá)了多段截斷的淀粉樣前體蛋白，并且其中部分蛋白的分離純化方法已經(jīng)建立，對APP蛋白領(lǐng)域的研究打下了良好的基礎(chǔ)，接下來我們將使用目的蛋白對APP部分功能結(jié)