白喉毒素-人B細胞活化因子融合蛋白對人急性白血病BALL-1細胞殺傷作用實驗性研究.pdf

1、第一部分白喉毒素/人B細胞活化因子融合蛋白的誘導表達、鑒定及純化
　　 研究背景：
　　 靶向治療的概念最早于1956年由德國化學家Ehdich提出，當前在抗腫瘤藥物研究中腫瘤靶向治療因其特異性強、副作用少等優(yōu)點而成為其中的重要研究領域，其主要作用機理是：將特異性的靶向載體與毒性物質通過一定方法連接起來，靶向載體定向將靶向治療藥物輸送到腫瘤部位，毒性物質殺傷腫瘤細胞。毒性物質亦稱為“彈頭”，主要包括毒素、放射性同位素和化

2、學藥物等。腫瘤靶向治療藥物中的免疫毒素由于其載體靶向特異性高和毒素殺傷性強的特性使其成為腫瘤靶向治療研究中的熱點領域。
　　 上世紀80年代，有研究者根據(jù)靶向治療的理念制造出了第一代免疫毒素，是利用化學偶聯(lián)的方法將毒素蛋白通過二硫鍵或硫醚鍵偶聯(lián)到與靶向載體上，在動物試驗中顯示了全身副作用低靶向殺傷力強的特性，常用的偶聯(lián)劑有：N-琥珀酰亞胺基-3-[2-吡啶二硫基]-丙酸酯(SPDP)、N-羥基琥珀酰亞胺、S-乙酰巰基琥珀酸酐等。

3、隨著分子生物學技術的發(fā)展，研究者利用基因重組技術將靶向載體與毒素分子重組融合構建出重組免疫毒素，此即第二代免疫毒素。研究者還通過基因重組技術來改良毒素的特性，比如：去除毒素結構中的細胞結合域來降低其非特異性毒性，通過基因突變來提高其殺傷腫瘤細胞作用等。另一方面，根據(jù)靶抗原的多樣性，研究者利用分子生物學技術構建出多樣性的載體。從免疫原性和毒性兩個方面進行改造，推動了免疫毒素研究的發(fā)展。
　　 構建免疫毒素的毒性分子種類很多，主要有

4、以下幾類：植物性毒素、細菌性毒素、人源性蛋白毒素、真菌性毒素等。構建免疫毒素常用的毒素分子之一白喉毒素(diphtheria toxin，DT)屬于細菌性毒素，是白喉桿菌被β噬菌體溶源化后，由β噬菌體tox基因編碼合成的外毒素，分子全長535aa，分子量為58330 D，分為3個彼此獨立的結構域：酶活性區(qū)(C區(qū))、跨膜轉運區(qū)(T區(qū))和膜受體結合區(qū)(R區(qū))，便于拆分操作，為設計免疫毒素提供了有利條件。
　　 利用分子生物學技術對白

5、喉毒素進行改造以適應構建免疫毒素的需要，比如采用截斷的DT(如DT388、DAB389等)，或者將DT分子中的T區(qū)去除或點突變，這樣就制備出了一系列DT的衍生物或DT的突變體(如CRM9、CRM107)，他們大多保留了C區(qū)和T區(qū)，也就保留了酶活性和跨膜轉運的功能；通過基因重組技術將DT分子中的R區(qū)突變失活或刪除，再用能特異性識別腫瘤細胞表面分子的結構，比如細胞因子、單克隆抗體等，取代R區(qū)的位置，這樣就能構建成白喉毒素類免疫毒素，它既能靶

6、向結合腫瘤細胞，又能靶向殺傷腫瘤細胞，而對正常細胞低毒。根據(jù)腫瘤細胞表面表達的特異性受體而對構建免疫毒素載體進行選擇，無外乎是能與之結合抗體、細胞因子及激素等。B細胞活化因子(B lymphocyte activating factor，BAFF)，也是一種細胞因子，可以與其在B細胞系細胞表面表達的受體結合，因此適宜作為免疫毒素的靶向載體。
　　 本研究就是以此為思路，利用截斷的DT388與B細胞活化因子(BAFF)通過基因重組

7、技術構建重組免疫毒素DT388sBAFF。
　　 研究目的：
　　 構建免疫毒素白喉毒素/人B細胞活化因子融合蛋白(DT388sBAFF)表達載體，誘導表達、鑒定并純化。
　　 研究方法：
　　 1.根據(jù)白喉毒素/人B細胞活化因子(DT388sBAFF)優(yōu)化合成的基因序列設計引物，經PCR擴增將DT388sBAFF插入到克隆載體pMD19-T，陽性克隆質粒通過菌落PCR篩選陽性克隆，提取DNA后經限制性內

8、切酶雙酶切，最后進行DNA測序鑒定確定目的基因序列。
　　 2.陽性克隆質粒pMD19-T-DT388sBAFF經雙酶切(NdeⅠ、XhoⅠ)，通過瓊脂糖凝膠電泳分離出目的基因DT388sBAFF，再插入表達載體pcoldⅡ中，構建重組表達載體pcoldⅡ-DT388sBAFF，轉化BL21感受態(tài)菌株發(fā)酵，后經菌落PCR鑒定陽性菌株。
　　 3.將陽性單克隆菌落挑取進行擴增培養(yǎng)，觀察至對數(shù)生長期后，通過IPTG誘導，行S

9、DS-PAGE分析和Western blot鑒定融合蛋白(DT388sBAFF)。
　　 4.利用Ni2+-NTA層析柱純化融合蛋白DT388sBAFF，后經透析，并通過SDS-PAGE分析檢測融合蛋白。
　　 結果：
　　 1.成功構建了人克隆質粒pMD19-T-DT388sBAFF，克隆基因序列的測序結果與目的基因DT388sBAFF序列完全一致。
　　 2.重組表達載體pcoldⅡ-DT388sBA

10、FF轉化BL21，經IPTG誘導，超聲破菌，SDS-PAGE結果顯示包涵體內的明顯蛋白條帶出現(xiàn)在58.4KD處，符合目的蛋白DT388sBAFF大小，獲得的融合蛋白通過利用圖像掃描分析，結果顯示其占菌體總蛋白的比例約為40％，Western blot檢測顯示融合蛋白分別與兩種抗體(抗His-Tag多克隆抗體和抗BAFF多克隆抗體)均發(fā)生了特異性結合反應，這表明獲得的融合蛋白為特異性目的蛋白DT388sBAFF，它以包涵體形式存在。

11、>　　 3.融合蛋白DT388sBAFF利用Ni2+-NTA層析柱進行純化，后經凝膠圖像掃描分析，最終目的蛋白DT388sBAFF純度達90％以上。
　　 結論：
　　 利用基因克隆技術成功構建了白喉毒素/人B細胞活化因子(DT388sBAFF)基因原核表達質粒pcoldⅡ-DT388sBAFF，在轉化BL21感受態(tài)細胞之后獲得了穩(wěn)定表達的工程菌株，并且在此過程中對融合蛋白DT388sBAFF的表達條件、提取包涵體步驟

12、以及其純化工藝等進行了探索優(yōu)化。
　　 第二部分白喉毒素/人B細胞活化因子融合蛋白的生物學活性檢測
　　 研究背景：
　　 B細胞活化因子(B lymphocyte activating factor，BAFF)，也被稱為BLyS的(B-淋巴細胞刺激因子)，TALL-1(TNF-α和APOL相關白細胞表達配體1)，或THANK(腫瘤壞死因子同源物，激活細胞凋亡，NKFB，和JNK)，是TNF(腫瘤壞死因子)的超家

13、族的成員，表達在單核細胞，樹突狀細胞(DC)，嗜中性粒細胞，基質細胞，活化T細胞，惡性B細胞和上皮細胞等表面。BAFF的受體有三種：BAFF-R，TACI(transmembrane activator and calcium modulator andcyclophilin ligand interactor，跨膜活化劑和鈣的調制器和親環(huán)素配體相互作用因子)和BCMA(B cell maturation protein，B細胞的成熟蛋

14、白)，它他們表達在B細胞發(fā)育的不同時區(qū)。BAFF-R主要在更成熟的B細胞中表達，從T1的過渡性B細胞階段開始。然而，最近的研究提出的證據(jù)表明，BAFF-R普遍表達于B細胞急性淋巴細胞白血病(ALL)細胞，其源于正常B細胞的祖細胞的轉化發(fā)展。其他的研究表明，構建BAFF和白樹種子儲藏蛋白(一種植物毒素)融合蛋白表現(xiàn)出對BAFF-R(+)B細胞淋巴瘤細胞的殺傷作用。
　　 融合蛋白對BAFF-R(+)B細胞淋巴瘤細胞的殺傷作用取決于

15、兩個方面，一是融合蛋白與這種細胞的結合能力，另一方面是融合蛋白的毒性基團對這種細胞的殺傷作用。結合能力主要是由細胞表面表達BAFF受體能力決定。Hmy2.CIR細胞是利用B淋巴母細胞構建的試驗用細胞株。利用實時熒光定量PCR技術檢測Hmy2.CIR細胞上BAFF受體mRNA表達水平，利用熒光素標記技術檢測重組免疫毒素與Hmy2.CIR細胞結合能力，最后利用細胞毒實驗檢測重組蛋白對Hmy2.CIR細胞的殺傷作用。
　　 研究目的：

16、
　　 檢測免疫毒素DT388sBAFF(白喉毒素/人B細胞活化因子融合蛋白)的生物學活性。
　　 研究方法：
　　 1.利用實時熒光定量PCR技術檢測B細胞株Hmy2.CIR細胞上BAFF三種受體(BAFF-R、TACI和BCMA)的表達水平。
　　 2.利用FITC熒光素標記技術檢測重組免疫毒素DT388sBAFF與B細胞株Hmy2.CIR細胞結合能力。
　　 3.重組免疫毒素DT388sBA

17、FF對Hmy2.CIR細胞的殺傷作用的檢測采用細胞毒性實驗實施。
　　 4.利用SPSS18.0統(tǒng)計軟件中的方差分析功能對結果進行統(tǒng)計學分析。
　　 結果：
　　 1.BAFF的三種受體BAFF-R、TACI和BCMA在B細胞株Hmy2.CIR細胞都表達，其中BAFF-R表達最高。
　　 2.在倒置熒光顯微鏡下可觀察利用FITC熒光素標記融合蛋白DT388sBAFF后的Hmy2.CIR細胞，視野里發(fā)現(xiàn)有較

18、強綠色熒光出現(xiàn)，而對照陰性組U937細胞視野則未見熒光，此結果表明融合蛋白DT388sBAFF與表達于Hmy2.CIR細胞表面的BAFF受體能夠特異性的結合。
　　 3.融合蛋白DT388sBAFF對Hmy2.CIR細胞較強的抑制作用通過細胞毒實驗檢測結果得以顯現(xiàn)，且具有劑量依賴關系，即隨著融合蛋白DT388sBAFF濃度的增加，Hmy2.CIR細胞被抑制的效應越強(P<0.05)，而不同濃度的融合蛋白DT388sBAFF之于對

19、照陰性組U937細胞沒有顯示具有統(tǒng)計學意義的抑制效應(P>0.05)。
　　 結論：
　　 獲得了具有靶向B細胞活性的免疫毒素DT388sBAFF，為其在B細胞惡性腫瘤及自身免疫性疾病治療中的應用研究奠定了基礎。
　　 第三部分白喉毒素/人B細胞活化因子融合蛋白對人急性白血病BALL-1細胞殺傷作用
　　 研究背景：
　　 急性白血病(acute leukemia)是兒童常見的血液系統(tǒng)腫瘤，急性淋

20、巴細胞白血病約占70％，其中80％來源于B細胞系，其發(fā)生率和病死率均呈上升趨勢，嚴重威脅人類，特別是兒童的健康。通常采用的聯(lián)合化療的治療方法，但這些治療措施抗腫瘤能力低，也就是選擇性差，并有明顯的全身毒副作用。長期使用非特異免疫抑制劑容易誘導藥物耐藥，并可使患者免疫功能受到嚴重損害，導致許多并發(fā)癥。
　　 免疫毒素由于其靶向治療的特點成為當前腫瘤治療研究的熱點領域之一。免疫毒素主要通過毒性分子中的不同結構域間的協(xié)調配合而發(fā)揮殺傷

21、作用，其過程主要包括：免疫毒素中的載體發(fā)揮靶向作用與目標細胞結合；免疫毒素中的毒性分子內化入細胞；毒性分子的活性作用主要是抑制蛋白表達，以致細胞死亡。
　　 免疫毒素的毒性部分主要來源有一下幾類：植物來源的毒素、細菌來源的毒素、人源性蛋白毒素以及真菌來源的毒素等。白喉毒素屬于細菌來源的毒素，含有于細胞結合區(qū)和酶活性區(qū)，C片段是其酶活性區(qū)，主要活性作用是失活核蛋白體上的肽鏈EF-2，從而抑制細胞合成蛋白質，導致細胞變性壞死，應用這

22、個優(yōu)勢特性發(fā)揮殺傷腫瘤細胞的作用。本研究通過以白喉毒素為毒性部分而構建免疫毒素DT388sBAFF來探討其是否對人急性白血病BALL-1細胞存在抑制作用，從而為急性白血病治療提供新的研究方向。
　　 研究目的：
　　 研究免疫毒素DT388sBAFF(白喉毒素/人B細胞活化因子融合蛋白)的對人急性白血病BALL-1細胞的殺傷作用。
　　 研究方法：
　　 1.利用實時熒光定量PCR技術檢測人急性白血病BA

23、LL-1細胞上BAFF三種受體(BAFF-R、TACI和BCMA)的表達水平。
　　 2.利用FITC熒光素標記技術檢測重組免疫毒素DT388sBAFF與人急性白血病BALL-1細胞結合能力。
　　 3.細胞毒性實驗檢測重組免疫毒素DT388sBAFF對人急性白血病BALL-1細胞的殺傷作用。
　　 4.利用SPSS18.0統(tǒng)計軟件中的方差分析功能對結果進行統(tǒng)計學分析。
　　 結果：
　　 1.B

24、AFF的三種受體(BAFF-R、TACI和BCMA)中，只有BAFF-R在人急性白血病BALL-1細胞上高表達(P<0.05)，TACI和BCMA基本不表達(P>0.05)。
　　 2.FITC熒光素標記重組免疫毒素DT388sBAFF后在倒置熒光顯微鏡下可觀察到人急性白血病BALL-1細胞有較強綠色熒光出現(xiàn)，而陰性對照組U937細胞則未見熒光，而陽性對照Hmy2.CIR細胞亦出現(xiàn)較強綠色熒光，而且急性白血病BALL-1細胞和陽

25、性對照Hmy2.CIR細胞只同時表達BAFF一種受體：BAFF-R，這表明重組免疫毒素DT388sBAFF與上述細胞表面受體BAFF-R具有特異性結合能力。
　　 3.細胞毒實驗檢測結果顯示了較強的抑制效應，即重組免疫毒素DT388sBAFF能抑制人急性白血病BALL-1細胞，且具有劑量依賴關系，即人急性白血病BALL-1細胞受抑制作用隨著重組免疫毒素DT388sBAFF濃度的增加，而越強(P<0.05)，這與陽性對照細胞Hmy