Roche454高通量測序初步分析人HBV疫苗接種前、后B細胞Igg-IgMH鏈CRD3受體庫的組成和特征.pdf

1、目的:
　　 1初步建立起Roche454高通量測序分析人B細胞BCR CDR3受體庫的技術(shù)流程和數(shù)據(jù)分析平臺。
　　 2觀察HBV疫苗接種前、后外周血中B細胞IgG&IgM H鏈CDR3受體庫的組成和特征。
　　 方法:
　　 1.在遵義醫(yī)學院2008級臨床醫(yī)學本科的在校大學生中，用電化學發(fā)光法檢測志愿者的HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb血清標志物，符合乙肝五項全部陰性診斷標準

2、的3位HBV疫苗志愿接種者。注射HBV疫苗三次(0，1，6個月，接種前及接種全程均排除自身免疫性疾病及惡性腫瘤)，于疫苗第一次接種前一天和接種第三次后14天各采集外周血15ml，提取每個樣本外周血單個核細胞(peripheral blood
　　 mononuclear cell，PBMC)的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。樣本序列號命名為：MID1=1號志愿者疫苗后樣本；MID2=1號志愿者疫苗前樣本；MID3=2號志愿者疫苗后樣

3、本；MID4=2號志愿者疫苗前樣本；MID5=3號志愿者疫苗后樣本；MID6=3號志愿者疫苗前樣本。
　　 2.采集3例HBV疫苗志愿接種者外周血5ml(EDTA-K2抗凝)，提取基因組DNA，采用PCR-SBT(Sequencing based typing.SBT)法測序HLA-A等位基因序列(華大基因完成)。
　　 3.設(shè)計6條IgG&IgM H鏈可變區(qū)上游引物和1條IgM下游引物，1條IgG下游引物(Invitr

4、ogen合成)；根據(jù)6個樣本合成6套，每條引物5’端設(shè)計10個特殊核苷酸組成的區(qū)分序列，PCR擴增各樣本B細胞IgM和IgG的重鏈引物間的區(qū)域(含完整的CDR3區(qū))。PCR產(chǎn)物電泳、割膠后，采用QIAGEN凝膠提取試劑盒(QIAquick Gel Extration Kit)，進行純化。
　　 4. Roche454高通量測序及數(shù)據(jù)分析，6個樣本測序由上海同濟大學同達科信生物技術(shù)發(fā)展有限公司采用Roche454 GS-FLX S

5、ystem測序完成。
　　 5.數(shù)據(jù)分析：通過每個樣本的特征標簽序列將獲取的總序列分到6個樣本中。按照每個樣本的特殊IgG/IgM引物序列，根據(jù)IMGT數(shù)據(jù)庫V-QUEST軟件和編程等，初步分析各樣本框架內(nèi)重排(in-flame)的B細胞BCR CDR3受體庫的IGHV、IGHD和IGHJ家族分布及CDR3區(qū)特征等(非框架內(nèi)重排和序列的突變等B細胞BCR CDR3特征，待IMGT數(shù)據(jù)庫中HighV-QUEST軟件注冊成功后另文分

6、析)。
　　 結(jié)果:
　　 13例HBV疫苗志愿接種者接種前，乙肝五項均為陰性，完成全程接種后14天，HBV表面抗體檢測全部大于10IU/L；3例志愿者的HLA-A位點分別為：AZ*0203和A*0207；A*0301和A*0207；A*2402和A*0201。
　　 26個樣本的Roche454測序數(shù)據(jù)共19891條：MID-1共4016條，其中完整的in-flame1368條；MID-2共2935條，其中完整

7、的in-frame418條；MID-3共2107條，其中完整的in-frame518條；MID-4共2875條，其中完整的in-frame470條；MID-5共4840條，其中完整的in-frame1103條；MID-6共3118條，其中完整的in-frame684條。6個樣本的in-frame數(shù)據(jù)在IMGT數(shù)據(jù)庫中的人B細胞各IgHV、IgHJ家族均有分布，每個樣本所獲數(shù)據(jù)量與目前發(fā)表相關(guān)文獻數(shù)據(jù)量一致。
　　 36個樣本in

8、-frame CDR3受體庫組成和特征初步分析：
　　 (1)每個志愿者疫苗接種前、后，高頻取用的IGHV、IGHD、IGHJ家族、IGHV-J家族配對和CDR3長度在一定程度上發(fā)生了改變。6個樣本的IgG和IgM IGHJ家族均高頻取用IGHJ4；IgM高頻取用的IGHD家族均為IGHD3和IGHD6；6個樣本IGHV家族取用中，MID1與MID2均高頻取用IGHV3家族；MID3和MID4均高頻取用IGHV1家族；MID5的

9、IgG和IgM及MID6的IgG均高頻取用IGHV4家族；MID5的IgM及MID6的IgG和IgM均高頻取用IGHV1家族。但在最高取用頻率的IGHV和IGHD家族中，MID2的IgG和IgM高頻取用的家族分別為IGHV4/IGHD1和IGHV3/IGHD6，而MID1的IgG和IgM高頻取用的IGHV家族均為IGHV3，IGHD家族分別為IGHD6和IGHD3；MID3和MID4的IgG和IgM高頻取用的家族均為IGHV1，而IGH

10、D家族分別為IGHD2和IGHD6；MID6的IgG和IgM高頻取用的家族分別為IGHV1/IGHD6和IGHV5/IGHD3，而MID5的IgG和IgM高頻取用的家族分別為IGHV4/IGHD4和IGHV1/IGHD6。
　　 (2)6個樣本的CDR3受體庫重疊分析：6個樣本的IgG和IgM受體庫，疫苗前、后樣本CDR3受體庫均有一定的重疊。將MID1、MID3、MID5 CDR3受體庫與NCBI數(shù)據(jù)庫中部分乙肝病毒表面抗體進

11、行比較，IGHV/J家族高頻取用情況基本一致，數(shù)據(jù)庫中的序列、MID1、MID3、MID5間未發(fā)現(xiàn)完全一致CDR3序列。
　　 (3)6個樣本的CDR3區(qū)氨基酸取用和長度分布分析：3例志愿者疫苗前、后氨基酸取用和長度分布均有顯著變化，且MID1、MID3、MID5均以14、15個氨基酸長度處為中線，呈偏正態(tài)分布。6個樣本CDR3區(qū)氨基酸的取用分析，每個志愿者均高頻取用丙氨酸(10.5％-12.7％)、酪氨酸(10.4％-12.6

12、％)、甘氨酸(10.3％-11.9％)、精氨酸(8.4％-11.4％)、天冬氨酸(9.9％-11.0％)、絲氨酸(6.4％-9.0％)。
　　 (4)疫苗接種后3個樣本(MID1，MID3，MID5)高頻取用IGHV/D/J家族、IGHV-J配對部分相同。MID1、MID3和MID5中，IGHJ區(qū)均高頻表達IGHJ4家族，而IGHV區(qū)均高頻表達IGHV1和IGHV3家族，IGHV3-J4及IGHV1-J4配對被高頻取用。

13、　　 注：6個樣本的測序數(shù)據(jù)中，框架內(nèi)重排的CDR1，CDR2區(qū)組成特征、IGHV和IGHJ區(qū)突變的頻率和特征、框架外重排的頻率等等另文進行分析；發(fā)表論文數(shù)據(jù)將以IMGT High V-QUEST最后統(tǒng)計的數(shù)據(jù)標準進行分析。
　　 結(jié)論:
　　 1.本實驗率先在國內(nèi)初步建立起Roche454高通量測序分析人B細胞BCR CDR3受體庫的技術(shù)流程和數(shù)據(jù)分析平臺，為開展人B細胞相關(guān)的生理和病理研究提供了新思路和強有力工具。