透明質(zhì)酸影響血管內(nèi)皮細胞生長及對CD44-膜連接蛋白Ezrin、Merlin表達的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：⑴分離培養(yǎng)并鑒定人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)，建立原代人血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)技術(shù)，為后續(xù)研究提供目的細胞。⑵探討用不同分子量HA誘導HUVEC后細胞的增殖能力變化和細胞連接蛋白Ezrin、Merlin的表達狀況。⑶建立原代HUVEC的RNA干擾(RNAi)技術(shù)，干擾目的基因Ezrin和Merlin的mRNA表達。⑷探討HUVEC Ezrin和Merlin基因沉默后，HA誘導細胞中Ezrin和Merlin表達與HA分子量的相關(guān)性。

2、 方法：①分離人臍靜脈內(nèi)皮細胞：取本院剖腹產(chǎn)新生嬰兒臍帶(約15-25cm)，生理鹽水灌注沖洗靜脈腔后，加入I型膠原酶消化分離人臍靜脈內(nèi)皮細胞，內(nèi)皮專用培養(yǎng)基EGM-2培養(yǎng)傳代。②免疫熒光檢測HUVEC細胞中Ezrin和Merlin的表達及分布。③分別合成三對針對Ezrin和Merlin基因的小干擾RNA，電穿孔法將各三對Ezrin和Merlin的siRNA導入HUVEC，接種于六孔板，EGM-2培養(yǎng)基正常培養(yǎng)，篩選最適合干擾的一對

3、siRNA片段。④用選定Ezrin siRNA片段干擾HUVEC，RT-PCR與Western-blot證明干擾效率。 結(jié)果：⑴原代培養(yǎng)細胞培養(yǎng)10-15左右天長成單層，細胞呈多角形，鋪路石樣排列。⑵免疫熒光證實HUVEC高表達Ezrin和Merlin。2.200μ g/ml nHA抑制HUVEC增殖，而10μg/mloHA促進HUVEC增殖。3.200μ g/ml nHA誘導HUVEC后Ezrin和Merlin mRNA表達沒

4、有顯著差異，10μ g/ml oHA誘導HUVEC后EzrinmRNA水平在24h顯著升高，Merlin mRNA及蛋白表達與對照相比無顯著性差異。⑶電穿孔法成功干擾原代HUVEC，細胞存活率達70—80％以上。建立電擊干擾原代HUVEC細胞模型；siRNA干擾后Ezrin和Merlin基因的mRNA的表達水平分別降低達80-90％，干擾效率較好。⑷RT-PCR與Western-blot證明Ezrin siRNA干擾HUVEC成功，符合

5、實驗要求；oHA誘導siEzrin HUVEC細胞增殖能力未發(fā)生顯著性改變，nHA誘導siEzrin HUVEC細胞增殖能力降低。 結(jié)論：①通過酶灌注法消化臍靜脈血管獲得細胞，操作簡便、高效，EGM-2培養(yǎng)基可保證內(nèi)皮細胞具有較高純度，細胞形態(tài)學觀察和細胞生物學鑒定證明獲得人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞。②不同分子量HA對血管內(nèi)皮細胞具有不同的增殖效應，高分子量HA抑制細胞增殖，低分子量HA促進細胞增殖；低分子量HA片段具有較為明確的促增

6、殖效應，且與蛋白Ezrin表達具有相關(guān)性，而高分子量HA抑制增殖效應與Merlin的相關(guān)性尚未明確。③siRNA成功干擾人臍靜脈內(nèi)皮細胞Ezrin和Merlin的表達，電穿孔法干擾原代培養(yǎng)細胞具有較好干擾效果，操作簡便，干擾效率高；干擾后Ezrin和Merlin基因的基因和蛋白表達水平顯著降低。④通過阻斷Ezrin分子在血管內(nèi)皮細胞中的表達，發(fā)現(xiàn)在Ezrin在失活或低表達狀態(tài)Merlin蛋白結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化，由失活變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，發(fā)揮抑制細