魚(yú)類鏈球菌的分離，鑒定和診斷技術(shù).pdf

1、魚(yú)類鏈球菌是近來(lái)年在水產(chǎn)養(yǎng)殖上出現(xiàn)的重要病原菌，對(duì)海水魚(yú)類的危害僅次于弧菌。80年代初曾在日本大規(guī)模流行，主要危害養(yǎng)殖鰤?mèng)~、牙鲆、真鯛、暗紋東方鲀、銀鮭等。90年代后，魚(yú)類鏈球菌病在美國(guó)、以色列、日本、韓國(guó)、等國(guó)發(fā)生，成為近年來(lái)給世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失的重要疾病，全世界每年因鏈球菌感染引起的經(jīng)濟(jì)損失已超過(guò)1.5億美元。
　　 海豚鏈球菌是魚(yú)類鏈球菌中的一個(gè)重要種，可危害多種養(yǎng)殖魚(yú)類，同時(shí)還可可引起人類感染，是水產(chǎn)養(yǎng)殖中少

2、數(shù)幾個(gè)有人類感染風(fēng)險(xiǎn)的病原菌之一。1991年在美國(guó)確診了第一例人類海豚鏈球菌感染后，至今全世界至少有30人確診為海豚鏈球菌感染。隨著我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展和人們對(duì)水產(chǎn)品需求量的增加，魚(yú)類鏈球菌感染和人類海豚鏈球菌存在上升的趨勢(shì)。
　　 本論文采用加有0.04％疊氮鈉的BHI、TSB、TH、SF四種液體培養(yǎng)基結(jié)合BHI固體培養(yǎng)基對(duì)人工感染黃顙魚(yú)的9個(gè)部位進(jìn)行鏈球菌的分離培養(yǎng)，確定以BHI 作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對(duì)鏈球菌的培養(yǎng)效果最好；

3、腦、腎、血液為最好的分離部位。選擇了噁喹酸鈉、硫酸粘桿菌素及鏈霉素三種抗生素作為雜菌抑制劑，通過(guò)三種抑菌劑對(duì)不同濃度海豚鏈球菌的抑制效果確定三種抑菌劑的使用濃度分別為0.06mg/mL、0.012mg/mL和25U/mL，噁喹酸與硫酸粘桿菌素的配比為1：2，研制了鏈球菌選擇性培養(yǎng)基——噁喹酸、硫酸粘桿菌素BHI培養(yǎng)基（BHICSOA），用該培養(yǎng)基對(duì)豬鏈球菌SS25995、海豚鏈球菌NUF693、擬態(tài)弧菌SsN0608、氣單胞菌MrM06

4、02及魚(yú)體樣品進(jìn)行鏈球菌培養(yǎng)，結(jié)果表明，BHICSOA培養(yǎng)基可有效抑制雜菌，對(duì)鏈球菌具有較強(qiáng)的選擇性，初步可作為鏈球菌的選擇性培養(yǎng)基。
　　 用BHICSOA培養(yǎng)基對(duì)市售常見(jiàn)水產(chǎn)動(dòng)物黏液和鰓、內(nèi)臟進(jìn)行了鏈球菌的分離培養(yǎng)，共分離36株鏈球菌類菌株，對(duì)部分菌株進(jìn)行了動(dòng)物回感和對(duì)小鼠的致病性試驗(yàn)，結(jié)果表明MrS3和TS對(duì)宿主有一定的致病性，海水魚(yú)分離株6?？梢鹦∈竽X膜炎，嚴(yán)重影響了小鼠的正常生長(zhǎng)；36株菌中有20株有溶血性，其中14

5、株為典型的β溶血。采用API 20STREP對(duì)部分分離株進(jìn)行了生化鑒定，發(fā)現(xiàn)分離菌株主要有淺綠色鏈球菌、乳房鏈球菌、豕鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌等，少數(shù)菌株因API系統(tǒng)參考菌株性狀不夠未能定種；用針對(duì)tuf基因的鏈球菌屬特異性引物對(duì)36株分離鏈球菌菌株進(jìn)行進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，有30株菌為擴(kuò)增陽(yáng)性，表明tuf基因可作為鏈球菌屬鑒定基因；建立了基于海豚鏈球菌LctO和16SrRNA基因的種特異性PCR鑒定法，該法可有效用于海豚鏈球菌的鑒定，30株tu

6、f陽(yáng)性菌株中未發(fā)現(xiàn)海豚鏈球菌菌株。
　　 以海豚鏈球菌SO3為抗原制備了兔高效免疫血清，間接ELISA效價(jià)為1：20480，經(jīng)親和層析、硫酸銨濃縮、活化生物素標(biāo)記，制備了生物素標(biāo)記兔抗海豚鏈球菌抗體，成功建立了雙夾心生物素抗體-鏈酶親和素ELISA檢測(cè)法(BA-ELISA法)，該方法對(duì)海豚鏈球菌特異性強(qiáng)，對(duì)豬鏈球菌、葡萄球菌等其他水產(chǎn)常見(jiàn)細(xì)菌無(wú)非特異性反應(yīng)，最低檢測(cè)限度為4~16×104cfu，適用于海豚鏈球菌的檢測(cè)；BA-EL

7、ISA還可用于對(duì)魚(yú)體鰓和黏液混合物的直接檢測(cè)，與PCR 的檢測(cè)法一致性為86.1％，表明該法可作為基層單位用于海豚鏈球菌的快速檢測(cè)。
　　 采用鏈球菌選擇性培養(yǎng)基對(duì)浙江省主要海水和淡水養(yǎng)殖魚(yú)類及部分市售海捕魚(yú)類的鰓和體表進(jìn)行了初步的分離和培養(yǎng)，結(jié)合PCR鑒定技術(shù)，對(duì)魚(yú)體攜帶海豚鏈球菌的基本情況進(jìn)行了初步的調(diào)查。結(jié)果表明：
　　 1）湖州、溫州、舟山和三門(mén)等地的淡水和海水魚(yú)類體表和鰓均有海豚鏈球菌的檢出，檢出率為10.6％

8、-47.5％不等。
　　 2)水產(chǎn)品市場(chǎng)和酒店魚(yú)類的海豚鏈球菌檢測(cè)率分別為30.9％和35.6％，表現(xiàn)較高的檢出率。
　　 3）海豚鏈球菌檢出率比例較高的海水魚(yú)類為石首魚(yú)科、帶魚(yú)科、鯔科、鰨科和鮨科魚(yú)類，淡水養(yǎng)殖魚(yú)類中海豚鏈球菌的檢出率較高的養(yǎng)殖品種主要為羅非魚(yú)、烏鱧、鱸魚(yú)、黃顙魚(yú)和鯰魚(yú)。
　　 4）養(yǎng)殖魚(yú)類海豚鏈球菌檢出率高于野生魚(yú)類，體表黏液比鰓更易檢出海豚鏈球菌。上述結(jié)果表明常見(jiàn)的養(yǎng)殖和野生魚(yú)類中存在較高的