NSCs三維培養(yǎng)及其微流控動態(tài)模型的構建.pdf

1、神經干細胞(Neural stem cells，NSCs)是一類能夠自我更新，并具有多向分化潛能的細胞。它的發(fā)現(xiàn)為深入研究神經系統(tǒng)的發(fā)育、神經退行性疾病治療以及受損神經組織的臨床移植帶來新的希望。而要實現(xiàn)NSCs的各種潛能則必須對其各種生理生化特性有正確的認識與了解。因此，體外構建與體內微環(huán)境相似的NSCs模型是深入研究NSCs各種生理機制的重要方法與手段，已成為神經科學與神經組織工程研究領域的熱點。
　　傳統(tǒng)的NSCs體外細胞模

2、型主要采用的是二維單層貼壁培養(yǎng)法和“神經球”懸浮培養(yǎng)法，細胞無法真正體現(xiàn)其在體內的生物學特性與功能。而以生物支架為基礎的細胞三維培養(yǎng)則被認為更加接近哺乳動物體內真實微環(huán)境，已經成為體外研究NSCs增殖與分化機制、藥物及環(huán)境毒素篩選與評價以及構建神經組織替代物的首選模型。目前，體外構建NSCs三維類神經組織的研究，在國內外還處于實驗探索階段，沒有標準化的實驗方法。因此，本文主要在NSCs體外三維培養(yǎng)方式及其生長與分化調控方面，開展了以下工

3、作:
　　(1)獲取原代小鼠NSCs(mNSCs)并對其加以鑒定。通過原代培養(yǎng)方法從孕齡14 d的昆明種小鼠胎腦的海馬組織中獲得mNSCs，考察了5個不同的接種密度對mNSCs生長趨勢、所形成的“神經球”大小的分布以及擴增倍數的影響。最終確定了原代mNSCs的最佳接種密度為1×105 cells/mL。傳代培養(yǎng)的mNSCs能夠穩(wěn)定表達NSCs特征蛋白(Nestin和Sox2)，經10％胎牛血清誘導能夠分化成神經元(β-tubuli

4、n-Ⅲ陽性)、星形膠質細胞(GFAP陽性)以及少突膠質細胞(O1陽性)，表明本實驗分離獲得的mNSCs具有自我更新與多向分化潛能。
　　(2)篩選并確定一種促進mNSCs體外擴增的無血清培養(yǎng)基MA。三維模型需要足夠的細胞數量，因此本研究采用正交試驗篩選并確定了能夠提高mNSCs擴增倍數的培養(yǎng)基添加組分及其濃度與比例，MA顯著地促進了mNSCs的增殖，細胞在對數增長期的最大密度可達到(7.25±0.23)×105cells/mL(p

5、＜0.01)，是初始接種密度((1.0±0.1)×105cells/mL)的7.25倍。同時，免疫熒光染色顯示，MA培養(yǎng)的mNSCs其Nestin的陽性表達率為94.2±3.5％，說明優(yōu)化后的培養(yǎng)基能很好地維持mNSCs的干細胞特性。同時，實驗結果顯示，MA中葡萄糖/谷氨酰胺配比對mNSCs生長有良好的促進作用，進一步確定了MA是一種適用于mNSCs體外擴增的新型優(yōu)良培養(yǎng)基。
　　(3)提出一種基于兩步培養(yǎng)的體外構建mNSCs三維

6、靜態(tài)模型的實驗方法。該方法以0.5mg/mL的(Ⅰ)型膠原水凝膠為支架材料，采用兩步培養(yǎng)法模擬體內神經發(fā)生的不同階段的生理微環(huán)境。培養(yǎng)初期采用添加了EGF/bFGF/BSA/Lipids的DMEM/F12/RPMI-1640的促mNSCs增殖的培養(yǎng)基MA，待細胞形成直徑至50-100μm左右的團簇時，將培養(yǎng)基MA更換為含有bFGF和BDNF生長因子的NB/B27條件培養(yǎng)基(MC)。團簇中的細胞開始沿著支架遷移，直到彼此相連形成神經組織樣

7、結構。此構建物內細胞生長狀態(tài)良好且分布均勻，活率在82％左右，14.17±2.62％細胞仍保持mNSCs特性，而神經元比率為40.93±1.85％，星形膠質細胞比率為27.13±1.63％。
　　(4)建立了一種基于微流控技術的NSCs三維動態(tài)培養(yǎng)方法。mNSCs三維培養(yǎng)技術與微流控技術相結合，設計并建立了一套適合mNSCs三維生長的微柱陣列式微流體芯片培養(yǎng)系統(tǒng)。實現(xiàn)了以膠原水凝膠為支架材料的mNSCs三維復合物在微流體芯片上的構

8、建與生長。結果顯示，利用靜態(tài)培養(yǎng)條件下建立的兩步法在芯片上構建的mNSCs三維復合物中有NSCs特征蛋白Nestin的表達，同時具備分化成神經元和星形膠質細胞的能力;對一個培養(yǎng)周期內的細胞代謝產物進行取樣分析，芯片三維培養(yǎng)體系中乳酸的濃度始終穩(wěn)定在1.0 mmol/mL以內，谷氨酰胺濃度維持在2.0 mmol/mL左右，為mNSCs的生長提供一個穩(wěn)定的生長環(huán)境;而三維靜態(tài)培養(yǎng)條件下乳酸濃度隨著半量換液在2.5～4.5 mmol/mL間波