以GPR40受體為靶點的細胞模型建立和唐順平對高脂喂養(yǎng)C57小鼠胰島素抵抗的改善作用及其機制探討.pdf

1、隨著飲食習慣和生活方式的改變,肥胖、胰島素抵抗、糖尿病的發(fā)病率迅猛增長,嚴重威脅著人們的身體健康和生活質(zhì)量?，F(xiàn)有口服降糖藥物的副作用以及其治療無效的病例不斷增加,使得研發(fā)新型安全有效的抗糖尿病口服藥物,成為藥物研發(fā)攻關的焦點。GPR40是新近發(fā)現(xiàn)的G蛋白偶聯(lián)受體家族成員,主要分布于胰腺β-細胞。研究證實GPR40是中、長鏈游離脂肪酸(FFAs)的受體,是介導FFAs的“增強葡萄糖刺激胰島素分泌”作用的主要途徑。激活GPR40受體,可以降

2、低血糖,其優(yōu)點是“糖依賴性”,較少或幾乎不引起低血糖反應。因此,GPR40已逐步成為治療糖尿病的新靶點之一,針對于該靶點的小分子GPR40激動劑的尋找已經(jīng)成為國內(nèi)外研發(fā)治療2型糖尿病藥物的新熱點。本研究致力于建立以GPR40信號通路為靶點的藥物篩選細胞模型,用于發(fā)現(xiàn)GPR40受體激動劑類的新型抗糖尿病藥物。胰島素抵抗是2型糖尿病、肥胖、心血管疾病以及動脈粥樣硬化等多種代謝性疾病的共同病理生理基礎。深入研究胰島素抵抗發(fā)生發(fā)展的機理,尋找理

3、想的胰島素增敏劑已成為各國科研工作者關注的焦點。胰島素抵抗病因復雜,中藥復方多成分,多靶點的作用,在改善胰島素抵抗方面有著極大的優(yōu)勢與潛力。唐順平是本實驗室在金芪降糖片的研究基礎上提取各單味藥(黃連、黃芪和金銀花)的有效部位重新組成的復方,本文旨在觀察其在高脂飲食誘導的胰島素抵抗動物模型的作用并探討其可能的作用機制
　　 第一部分成功建構(gòu)了以人源GPR40信號通路為靶點的HEK293細胞模型。首先利用基因工程重組技術構(gòu)建相關質(zhì)粒

4、:人源GPR40蛋白跨膜表達質(zhì)粒:Peak13-CD5L-hGPR40；受GPR40下游信號調(diào)控的hElk1激活結(jié)構(gòu)域與Gal4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)融合蛋白表達質(zhì)粒:pCMV-hElk1-Gal4-tag5A；以及6拷貝的Gal4應答元件調(diào)控的熒光素酶報告基因質(zhì)粒:Peak12-6×Gal4-luci。然后,將三個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細胞株,加入不同濃度的內(nèi)源性、外源性GPR40激動劑,以驗證該細胞模型對GPR40激動劑的反應

5、性和特異性。結(jié)果顯示,該細胞模型對GPR40的內(nèi)源性配體--軟脂酸以及人工合成GPR40小分子激動劑——GW9508的激活反應靈敏,具有特異性。目前,已將這種細胞模型用于GPR40激動劑篩選工作中,而進一步的優(yōu)化工作也正在進行中,目的是使該細胞模型應用于高通量篩選。
　　 第二部分評價了唐順平對高脂飲食誘導的胰島素抵抗動物模型的影響,并探討其可能的作用機制。高熱量、高脂飲食喂養(yǎng)雄性成年C57BL/6J小鼠(HF-C57)3-4月

6、,可以誘發(fā)胰島素抵抗。該模型具有明顯肥胖、空腹血糖升高、血脂紊亂,同時伴有葡萄糖耐量異常,胰島素耐量異常,高胰島素血癥等類似人類2型糖尿病的特征,是一種較為理想的具有人類胰島素抵抗病理特征的動物模型,適用于尋找胰島素增敏劑的開發(fā)研究。唐順平可以明顯改善模型動物的胰島素抵抗癥狀:主要表現(xiàn)在能夠改善胰島素耐量異常、葡萄糖耐量異常,增加高血糖鉗夾的葡萄糖輸注速率,改善高胰島素血癥、增加胰島素敏感指數(shù)。其可能通過降低體重,減少異位脂肪堆積,改善