抑制Kupffer細(xì)胞NF-κB介導(dǎo)的炎癥通路改善C57-BL6小鼠追趕生長和高脂飲食所致胰島素抵抗.pdf

1、目的：觀察追趕生長和高脂飲食導(dǎo)致胰島素抵抗的C57BL/6小鼠全身和主要胰島素敏感性組織的胰島素敏感性和炎癥情況以及采用siRNA選擇性阻斷Kupffer細(xì)胞NF-κB活性的影響，探索Kupffer細(xì)胞IKKβ/NF-κB炎癥通路在全身胰島素抵抗發(fā)生過程中的作用。
　　方法：6周齡的雄性C57BL/6小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，采用體重因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計分為正常對照組（normal control group, NC,n=10），高脂飲食

2、組(high fat diet group, HF,n=30)，追趕生長組(catch-up growth group, CH, n=30)。NC組給予普通飼料，自由攝食12周。HF組前四周給予普通飼料攝食，4周后給予高脂飼料自由攝食，在8周末，將HF組分為高脂飲食組（high fat diet induced insulin resistance group, HF, n=10），高脂飲食NF-κB p65siRNA干預(yù)組（high

3、fat diet with NF-κB p65 siRNA intervention group, HFPS, n=10）和高脂飲食對照siRNA干預(yù)組（high fat diet with NC siRNA intervention group, HFNS, n=10）。CH組前四周給予NC組同體重小鼠進(jìn)食量的50％，4周后給予高脂飼料自由攝食。在8周末，將CH組分為追趕生長組（catch-up growth induced insu

4、lin resistance group, CH, n=10），追趕生長NF-κB p65siRNA干預(yù)組（catch-up growth with NF-κBp65siRNA intervention group, CHPS, n=10）和追趕生長對照siRNA干預(yù)組（catch-up growth with NC siRNA intervention group, CHNS, n=10）。siRNA干預(yù)方式為尾靜脈注射，每四天一次，

5、共7次，每次注射15nmol/只。每日測定體重和進(jìn)食量，分別于四周末、八周末和十二周末行IPGTT、ITT，測定血清胰島素。通過計算IPGTT、ITT的曲線下面積和HOMA-IR反映系統(tǒng)胰島素敏感性。Western法檢測肝臟和骨骼肌的AKT和p-AKT以反映肝臟和骨骼肌的胰島素敏感性。采用生化法測定血清中甘油三酯、游離脂肪酸和膽固醇，肝臟的甘油三酯，脂肪和腓腸肌的甘油三酯和脂肪酸含量。 ELISA法測定血清和組織（肝臟、脂肪和骨骼肌）的

6、TNF-α，IL-6水平。RT-PCR法檢測肝臟中巨噬細(xì)胞活化指標(biāo)CD68，F(xiàn)4/80，CD11c的表達(dá)。ELISA法測定肝臟和脂肪的NF-κB p65活性。
　　結(jié)果：1：追趕生長小鼠和高脂飲食小鼠的體重明顯增加(與NC組比較，分別增長7.8％和15.5％），主要表現(xiàn)為內(nèi)臟型肥胖（與NC組比較，內(nèi)臟脂肪/體重比分別增加100％和138％），并伴隨血甘油三酯（p<0.01），游離脂肪酸（p<0.01）和膽固醇的升高。NF-κB p

7、65 siRNA干預(yù)減輕胰島素抵抗小鼠高脂飲食所致的體重增長（p<0.01）、明顯改善內(nèi)臟脂肪/體重比（CHPS組比CH下降21.4％，HFPS組比HF下降38％）和血脂水平（p<0.01）。
　　2：追趕生長小鼠和高脂飲食小鼠的肝臟甘油三酯含量增加（p<0.01），肝臟、內(nèi)臟脂肪和骨骼肌的脂肪酸水平增加（p<0.01），肝臟的HE染色可見大量的脂滴沉積和炎癥細(xì)胞浸潤，表明追趕生長和高脂飲食組小鼠出現(xiàn)明顯的脂質(zhì)異位沉積。NF-κB

8、 p65 siRNA干預(yù)后，組織的脂質(zhì)水平有明顯下降（p<0.01），肝臟的脂滴沉積和炎癥細(xì)胞浸潤有所減少。
　　3：追趕生長小鼠和高脂飲食小鼠血清、肝臟、脂肪和骨骼肌的TNF-α、IL-6均明顯升高（p<0.05）；肝臟 Kupffer細(xì)胞明顯激活（p<0.001），以 M1型為主（p<0.05）；肝臟和脂肪組織中轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化明顯增加（p<0.05）。經(jīng)NF-κB p65干預(yù)后，循環(huán)和組織中的TNF-α和 IL-6水平

9、明顯下降（p<0.05），Kupffer細(xì)胞的激活受到抑制（p<0.001），肝臟和脂肪的NF-κB活化水平下降（p<0.05）。
　　4：追趕生長小鼠和高脂飲食小鼠隨著高脂飲食時間的延長，全身系統(tǒng)性胰島素敏感性下降（IPGTT、ITT曲線下面積增加,HOMA-IR值升高）,肝臟和骨骼肌出現(xiàn)明顯的胰島素抵抗（pAKT/AKT降低）。NF-κB p65 siRNA干預(yù)四周后，全身胰島素敏感性以及肝臟和骨骼肌組織的胰島素敏感性均有不同

10、程度的改善。
　　結(jié)論：追趕生長和高脂飲食導(dǎo)致的胰島素抵抗小鼠具有內(nèi)臟型肥胖、血脂異常和胰島素抵抗的表型特征。上述模型同時表現(xiàn)出肝臟和骨骼肌組織脂質(zhì)異位沉積，循環(huán)和胰島素敏感性組織中促炎因子TNF-α、IL-6增高。其肝臟Kupffer細(xì)胞促炎性活化增強(qiáng)，肝臟和骨骼肌的NF-κB被激活。采用siRNA靶向抑制Kupffer細(xì)胞NF-κB活性在減少Kupffer細(xì)胞活化、減輕肝臟炎癥和胰島素抵抗的同時遏制內(nèi)臟型肥胖的進(jìn)展并改善全身的