Skp2-RNAi對人子宮內(nèi)膜癌移植瘤生長的影響.pdf

1、目的：
　　研究慢病毒載體介導(dǎo)的特異性S期激酶相關(guān)蛋白2（Skp2）RNA干擾對人子宮內(nèi)膜癌HEC-1-A細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生長的影響，并探討其在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的可能作用機(jī)制，為子宮內(nèi)膜癌的基因治療提供新的靶點(diǎn)及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　應(yīng)用RNA干擾（RNAi）技術(shù)，將課題組前期成功構(gòu)建的針對Skp2基因的重組慢病毒表達(dá)載體LV-Skp2-shRNA及陰性對照空載體LV-Skp2-NC分別體外轉(zhuǎn)染人子宮內(nèi)膜癌HE

2、C-1-A細(xì)胞。倒置熒光顯微鏡結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測和分選出轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)。將HEC-1-A組細(xì)胞、LV-Skp2-NC組（LV-Skp2-NC/HEC-1-A）細(xì)胞、LV-Skp2-shRNA組（LV-Skp2-shRNA/HEC-1-A）細(xì)胞分別接種于裸鼠皮下，建立裸鼠皮下移植瘤模型。每天觀察裸鼠一般情況及皮下移植瘤的生長，每4天測量皮下移植瘤長短徑計(jì)算瘤體體積并繪制移植瘤生長曲線；4周后斷頸處死裸鼠，計(jì)算皮下移植瘤的體積、瘤重

3、，計(jì)算腫瘤生長抑制率；蘇木素-伊紅染色(HE染色)觀察移植瘤組織病理形態(tài)學(xué)變化；半定量RT-PCR法和Western blot法分別檢測移植瘤組織中Skp2、p27的mRNA和蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1.將LV-Skp2-NC、LV-Skp2-shRNA體外轉(zhuǎn)染HEC-1-A細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率70％左右，經(jīng)流式細(xì)胞儀分選后所得細(xì)胞轉(zhuǎn)染比例達(dá)90%以上，傳代后轉(zhuǎn)染率無明顯下降。
　　2.移植瘤生長曲線顯示，與HEC-

4、1-A組、LV-Skp2-NC組相比，LV-Skp2-shRNA組裸鼠皮下移植瘤成瘤潛伏期延長且生長緩慢，瘤體體積及重量均明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），腫瘤生長抑制率為77.4±4.8%。
　　3.HE染色結(jié)果顯示，HEC-1-A組、LV-Skp2-NC組腫瘤組織細(xì)胞異型性明顯，細(xì)胞密集不規(guī)則，細(xì)胞核深染，病理性核分裂多，肌層浸潤明顯，侵襲能力強(qiáng)。
　　4.半定量RT-PCR及Western blot結(jié)果表明，

5、LV-Skp2-shRNA組與其它兩組相比，移植瘤組織中Skp2的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，抑制率分別為70±1.3%、65.1±1.7%；p27在mRNA水平無明顯改變，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而在蛋白水平表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，增長率為（61.9±0.4%）。
　　結(jié)論：
　　應(yīng)用慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)，靶向沉默人子宮內(nèi)膜癌HEC-1-A細(xì)胞中