氨磷汀的抗輻射損傷作用及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分氨磷汀的抗輻射損傷作用研究
　　 目的:研究氨磷汀的抗輻射作用，尤其是對(duì)外周血細(xì)胞以及骨髓細(xì)胞的保護(hù)作用，為氨磷汀進(jìn)一步應(yīng)用于臨床以及核戰(zhàn)爭(zhēng)抗輻射作用提供依據(jù)。方法:清潔級(jí)ICR小鼠，雌雄各半，按體重隨機(jī)分為正常組、模型組、氨磷汀低劑量組(120 mg/kg)、中劑量組(240 mg/kg)、高劑量組(480 mg/kg)。5組小鼠連續(xù)給藥3天，第3天在給藥結(jié)束15～30分鐘內(nèi)對(duì)除正常組以外的其他4組小鼠給予60Coγ射

2、線全身照射，其中30 d存活率及存活天數(shù)試驗(yàn)照射劑量為8Gy，其余試驗(yàn)照射劑量均為6Gy，然后觀察輻射及氨磷汀對(duì)小鼠30d存活率的影響、體重及外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響、氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響、造血免疫器官的影響。同時(shí)取另一批ICR小鼠，雌雄各半，按體重隨機(jī)分為正常組、模型組、氨磷汀給藥組(480 mg/kg)。3組小鼠連續(xù)給藥3天，第3天在給藥結(jié)束15～30 min內(nèi)對(duì)除正常組以外的其他兩組小鼠給予60Coγ射線全身照射，輻射后6、12、24

3、h取小鼠骨髓細(xì)胞進(jìn)行凋亡測(cè)定。結(jié)果:(1)30 d存活率及存活天數(shù):低劑量組、中劑量組、高劑量組的平均存活時(shí)間與模型組相比均延長(zhǎng)，尤其是高劑量組延長(zhǎng)小鼠存活時(shí)間與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)體重:輻射后第1天、第4天，模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組體重均下降，且與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;輻射后第7天、第14天，模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠體重一直呈上升趨勢(shì)，僅模型組與正常組小鼠體重的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;第21天至實(shí)

4、驗(yàn)結(jié)束，各組小鼠體重均呈上升趨勢(shì)，且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(3)血液學(xué)指標(biāo):輻射后至第7天，模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)與正常組小鼠相比急劇下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而高劑量組外周血白細(xì)胞數(shù)比模型組小鼠高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，輻射后第14天，模型組、低劑量組、中劑量組小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)與正常組小鼠相比仍下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而高劑量組小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)與正常組小鼠的差異已無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，輻射后第21天開(kāi)始直至實(shí)驗(yàn)

5、結(jié)束，模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)與正常組小鼠相比差異已無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;輻射后第1、4、7天，模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠外周血RBC數(shù)與正常組小鼠相比下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，輻射后第14天，模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠外周血紅細(xì)胞數(shù)與正常組小鼠相比下降，但只有模型組和低劑量組與正常組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，輻射后第21天開(kāi)始直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠外周血紅細(xì)胞

6、數(shù)與正常組小鼠相比差異已無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;輻射后第1、4、7天，模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠外周血淋巴細(xì)胞數(shù)與正常組小鼠相比下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而高劑量組外周血淋巴細(xì)胞數(shù)比模型組小鼠高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，輻射后第14天，模型組、低劑量組、中劑量組小鼠外周血淋巴細(xì)胞數(shù)與正常組小鼠相比仍下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，輻射后第28天，所有小鼠外周血淋巴細(xì)胞數(shù)與正常組小鼠相比差異已無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;輻射后第14天，模型組、低劑量組小鼠外

7、周血小板數(shù)與正常組小鼠相比急劇下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而中劑量組和高劑量組小鼠外周血小板數(shù)與正常組小鼠的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(4)氧化應(yīng)激指標(biāo):輻射后第3天，模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠的SOD活力均比正常組小鼠的SOD活力降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而中劑量組和高劑量組小鼠的SOD活力比模型組小鼠的SOD活力升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;輻射后第7天，模型組、低劑量組小鼠的MDA含量均比正常組小鼠的MDA含量升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

8、意義，而中劑量組和高劑量組小鼠的MDA含量比模型組小鼠的MDA含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而與正常組小鼠的MDA含量相比無(wú)差異。(5) TI與SI:輻射后第3天，模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠的TI和SI與正常組小鼠相比均下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠的TI和SI與模型組相比均升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(6)胸腺、脾臟與骨髓組織病理學(xué)檢查:模型組和給藥組胸腺皮質(zhì)淋巴細(xì)胞均減少，胸腺萎縮，與正常組差

9、異顯著。但各個(gè)劑量組以及模型組之間未見(jiàn)明顯差異;組織病理學(xué)鏡下觀察各組小鼠脾臟組織可見(jiàn):模型組與正常組對(duì)比，淋巴細(xì)胞減少，脾臟造血細(xì)胞基本缺如，紅細(xì)胞數(shù)目上升。給藥組與模型組對(duì)比，淋巴細(xì)胞數(shù)目增多，造血細(xì)胞數(shù)量相對(duì)升高，脾小體數(shù)目和體積均增多、增大，且有著量-效依賴(lài)關(guān)系;組織病理學(xué)鏡下觀察各組小鼠骨髓組織可見(jiàn):模型組骨髓內(nèi)造血細(xì)胞減少，成熟紅細(xì)胞大量填充，造血功能低下。給藥組與模型組對(duì)比，骨髓腔內(nèi)造血細(xì)胞較多，造血功能較強(qiáng)，且有著量-效

10、依賴(lài)關(guān)系。(7)細(xì)胞凋亡:小鼠受輻射后24 h內(nèi)細(xì)胞凋亡發(fā)生率逐漸升高，模型組小鼠各時(shí)間點(diǎn)的骨髓細(xì)胞凋亡率與正常組相比均明顯升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而氨磷汀可明顯抑制輻射造成的小鼠骨髓細(xì)胞凋亡率的升高，且與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:氨磷汀可提高受輻射小鼠的存活率，延長(zhǎng)存活時(shí)間;促進(jìn)受輻射小鼠外周血白細(xì)胞、紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和血小板的恢復(fù);提高TI和SI;抑制脾臟和骨髓組織的損傷;增強(qiáng)受輻射小鼠機(jī)體的SOD活力，降低MDA水平;

11、明顯抑制輻射造成的小鼠骨髓細(xì)胞凋亡率的升高，因此氨磷汀對(duì)輻射后小鼠在血液、抗氧化、免疫和造血四個(gè)方面，均顯示出一定的保護(hù)和恢復(fù)作用。
　　
　　 第二部分氨磷汀抑制輻射誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究
　　 目的:利用HL-60人原髓細(xì)胞白血病細(xì)胞系，K562人慢性髓原白血病細(xì)胞系以及免疫磁珠分選(Magnetic activated cell sorting，MACS)技術(shù)獲得的骨髓造血干/祖細(xì)胞進(jìn)一步探討輻射造成

12、骨髓損傷的原因與機(jī)制，輻射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是否存在特有的分子機(jī)制以及氨磷汀保護(hù)受輻射骨髓細(xì)胞的機(jī)制。方法:HL-60細(xì)胞、K562細(xì)胞給予不同劑量的氨磷汀后15～30 min內(nèi)進(jìn)行60Coγ射線照射，照射劑量為6Gy，24 h后對(duì)HL-60細(xì)胞、K562細(xì)胞進(jìn)行凋亡測(cè)定;30只小鼠，雌雄各半，按體重隨機(jī)分為正常組、模型組、氨磷汀給藥組(480 mg/kg)，3組小鼠連續(xù)給藥3天，第3天在給藥結(jié)束15～30分鐘內(nèi)對(duì)除正常組以外的其他兩組小鼠給

13、予60Coγ射線全身照射，輻射后24 h取骨髓細(xì)胞進(jìn)行CD117+細(xì)胞計(jì)數(shù)，并利用MACS法分選骨髓造血干/祖細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行凋亡測(cè)定，并用Western Blot方法對(duì)骨髓造血干/祖細(xì)胞中的p53、p21、mdm2及c-myc基因所表達(dá)的蛋白進(jìn)行定量。結(jié)果:(1)輻射后24 h，HL-60細(xì)胞隨著氨磷汀給藥量的增加，其凋亡率較正常組也逐漸增加。(2)輻射后24 h，K562細(xì)胞隨著氨磷汀給藥量的增加，其凋亡率較正常組也逐漸增加。(3)小

14、鼠輻射后24 h后，對(duì)骨髓細(xì)胞進(jìn)行CD117抗體標(biāo)記，得到骨髓中CD117+細(xì)胞的百分比，模型組小鼠骨髓細(xì)胞中CD117+細(xì)胞的百分比與正常組相比明顯下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而氨磷汀給藥小鼠骨髓細(xì)胞中CD117+細(xì)胞的百分比與模型組相比有所上升，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(4)小鼠受輻射后24 h，模型組小鼠的骨髓造血干/祖細(xì)胞凋亡率與正常組相比均明顯升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而氨磷汀給藥組可抑制輻射造成的小鼠骨髓細(xì)胞凋亡率的升高，且與模型