QDs-SA量子點熒光成像阿爾茨海默病細胞模型APP、Aβ蛋白的實驗研究.pdf

1、背景與目的: 阿爾茨海默病是以進行性認知功能障礙和行為損害為主要特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變。β-淀粉樣蛋白是阿爾茨海默病特征性的病理改變老年斑的主要成分，已有研究表明阿爾茨海默病發(fā)病早期即存在Aβ蛋白的沉積，其沉積部位、面積和量與AD認知功能障礙程度密切相關(guān)。量子點是一種新型的熒光分子探針，與傳統(tǒng)的熒光染料相比，具有熒光強度高、光學穩(wěn)定性好等優(yōu)勢，將量子點與APP、Aβ蛋白特異結(jié)合，發(fā)展AD分子光學成像技術(shù)，指導阿爾茨海默病的

2、早期診斷具有廣闊的發(fā)展前景。本項目擬構(gòu)建pcDNA3.1/APP595/596并列突變質(zhì)粒，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入人胚腎HEK293細胞，建立阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因細胞模型；應(yīng)用量子點對APP、Aβ蛋白靶向標記，并將其與傳統(tǒng)熒光染料對比，在評估量子點生物相容性的同時，獲取量子點熒光成像強度和熒光穩(wěn)定性的相關(guān)資料，為量子點早期應(yīng)用于阿爾茨海默病的分子影像診斷打下基礎(chǔ)。 方法: 1)對pcDNA3.1/APP質(zhì)粒(美國Pittsburgh大

3、學的Perez博士惠贈)進行測序，證實除質(zhì)粒本身第595和596位氨基酸密碼子存在并列突變外，序列的第4位堿基有意外突變(C→G)，并影響到正常氨基酸的表達，亮氨酸( Leu)變成了纈氨酸(Val)。因此實驗擬行質(zhì)粒APPcDNA第4位堿基的定點突變。從原始質(zhì)?？寺∧０逯?，利用PCR 方法擴增目的基因APP695cDNA，將目的基因和目的載體pcDNA3.1分別酶切；純化酶切產(chǎn)物后定向連接，并將其轉(zhuǎn)化細菌感受態(tài)細胞，對長出的克隆

4、行PCR鑒定，PCR鑒定為陽性的克隆送測序并行比對分析。2)將點突變后pcDNA3.1/APP595/596質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293細胞建立穩(wěn)定表達株，細胞免疫熒光和Western-blot方法檢測轉(zhuǎn)染細胞APP的表達和Ap蛋白生成情況。3)采用細胞形態(tài)學、MTT分析法結(jié)合流式細胞檢測凋亡技術(shù)，系統(tǒng)考察QDs-SA量子點(濃度2.5～25nm)對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/APP595/596質(zhì)粒的HEK293細胞的毒性作用。4)應(yīng)用激光共

5、聚焦熒光成像和流式細胞技術(shù)，對QDs-SA量子點靶向標記阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因細胞模型中APP、Aβ蛋白的熒光進行檢測，同時與基于傳統(tǒng)熒光染料標記的免疫熒光分析方法進行比較。 結(jié)果: 1)應(yīng)用DNAStar軟件對陽性克隆測序結(jié)果與GenBank中APP基因序列比對，證實原序列中的錯義突變G已被突變回C，第4位點堿基定點突變完成，pcDNA3.1/APP595/596并列突變質(zhì)粒構(gòu)建成功。 2)Westem-blot在

6、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1/APP595/596質(zhì)粒的細胞中檢測到目的條帶，而轉(zhuǎn)染空載體組細胞未見APP蛋白表達。細胞免疫熒光染色后，共聚焦熒光顯微鏡下觀察APP基因轉(zhuǎn)染后能夠生成APP和Aβ蛋白，前者主要定位于細胞胞膜，Aβ蛋白主要表達于近膜胞漿，細胞膜上也有表達。3)在2.5～25nm濃度范圍內(nèi)，與QDs-SA量子點共育24小時后，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的HEK293細胞形態(tài)學無明顯改變； MTT示量子點作用細胞吸光度值與對照組相比未見

7、明顯差異；不同濃度量子點組間吸光度值比較亦無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。流式細胞檢測空白對照組與各濃度組間凋亡早期細胞百分率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。4)在波長為388nm紫外光激發(fā)下，QDs-SA量子點的最大熒光發(fā)射峰波長約為605±10nm，半峰寬小于35nm。激光共聚焦顯微鏡熒光分析示QDs-SA量子點標記APP和Aβ蛋白相較于傳統(tǒng)Cy3熒光染料的平均熒光密度值更大(P<0.05)；488nm激發(fā)光連續(xù)激發(fā)12分鐘，QDs

8、-SA量子點熒光標記的APP和Aβ蛋白仍發(fā)射較強的橙紅色熒光，熒光強度分別下降了27.87％、29.25％，而傳統(tǒng)熒光染料Cy3熒光強度下降幅度高達79.60％和76.82％。流式細胞儀檢測QDs-SA量子點和Cy3活細胞標記膜蛋白APP陽性率差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)，QDs-SA量子點熒光標記APP蛋白的流式熒光圖形呈寬端型，Cy3標記的APP流式熒光圖形呈扁平形，平均熒光強度差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 結(jié)論:

9、 1)成功構(gòu)建了在真核細胞中能高效表達人APP和Aβ蛋白的真核表達載體，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEK293細胞建立阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因細胞模型。2)在一定的濃度范圍內(nèi)，QDs-SA量子點對細胞形態(tài)學、細胞生長和增殖活性無明顯影響，具有較好的生物相容性。3)QDs-SA量子點能有效識別阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因細胞模型中APP和Aβ蛋白；QDs-SA量子點標記APP和Aβ蛋白熒光成像在光穩(wěn)定性和熒光強度等方面均優(yōu)于傳統(tǒng)的Cy3熒光染料標記的免疫熒光成像