臍血單個(gè)核細(xì)胞體外擴(kuò)增后植入NOD-SCID小鼠重建多系造血的研究.pdf

1、臍血以其采集方便、干細(xì)胞含量豐富、GVHD發(fā)生率低而成為造血重建的重要干細(xì)胞來源。但單份臍血所含的造血細(xì)胞數(shù)往往僅能用于兒童和低體重成人患者，臍血的體外擴(kuò)增有望克服這一障礙，但擴(kuò)增后臍血造血細(xì)胞的植入能力是否受到影響，造血重建能力能否得以維持是國內(nèi)外學(xué)者和臨床醫(yī)生關(guān)注的熱點(diǎn)。 本實(shí)驗(yàn)室以往的研究證實(shí)了以臍血單個(gè)核細(xì)胞(MNC)為起始培養(yǎng)細(xì)胞不僅減少細(xì)胞損失簡化實(shí)驗(yàn)操作，而且能夠?qū)崿F(xiàn)有效的擴(kuò)增，為此我們繼續(xù)探討臍血MNC擴(kuò)增后移植

2、動(dòng)物的情況，嘗試尋找一套擴(kuò)增后臍血應(yīng)用于臨床移植的完整可行方案。目的探討臍血MNC在體外擴(kuò)增后植入能力的改變以及對NOD/SCID小鼠造血重建的影響，尋找擴(kuò)增后臍血應(yīng)用于臨床移植的可行方法。 材料與方法： 1.臍血來源：采自足月正常分娩的健康產(chǎn)婦后ACD-A抗凝，共采集10例，均來源廣州醫(yī)學(xué)院附屬廣州市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科和廣東省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科。 2.動(dòng)物與飼養(yǎng)：6～8周齡NOD/SCID小鼠36只，購自中山大學(xué)實(shí)

3、驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于該中心無特定病原體(SPF)環(huán)境。 3.臍血MNC的分離與液體懸浮培養(yǎng)：臍血采集6小時(shí)內(nèi)用HES聯(lián)合FicollHypaque密度梯度離心法提取MNC，按1×106/ml接種于含無血清培養(yǎng)基的50ml培養(yǎng)瓶中，在5％CO2，37℃及飽和濕度條件下連續(xù)培養(yǎng)14天。按細(xì)胞因子組合的不同分組如下：A組：空白對照，不加任何細(xì)胞因子；B組：加入SCF、FL和IL6；C組：加入SCF、FL、IL-6和IL-3。分別在培養(yǎng)的

4、0天，6天，10天，14天取出少量細(xì)胞用于計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)，CD34+、CD34+38-細(xì)胞百分含量檢測及CFU、CFU-GEMM集落培養(yǎng)。 4.造血祖細(xì)胞集落培養(yǎng)：將細(xì)胞按2×105/ml接種到含甲基纖維素半固體培養(yǎng)基的24孔板中，置5％CO2，37℃及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天，計(jì)數(shù)CFU，培養(yǎng)至21天時(shí)，計(jì)數(shù)CFU-GEMM。 5.凋亡標(biāo)記AnnexinV的檢測：嚴(yán)格按AnnexinV試劑盒說明書操作處理0.5×10

5、5個(gè)MNC，流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞的百分率。 6.人臍血細(xì)胞移植NOD/SCID小鼠：36只NOD/SCID小鼠給予250cGy的半致死劑量照射(6WVX射線加速器)，照射率300cGy/min，照射后4小時(shí)內(nèi)從尾靜脈注入200μl生理鹽水或MNC懸液(含5×106細(xì)胞)。實(shí)驗(yàn)分組：擴(kuò)增組：18只輸注C組擴(kuò)增后臍血細(xì)胞；未擴(kuò)增組：9只輸注等量新鮮臍血MNC；空白對照組：9只輸注200μl生理鹽水。移植后觀察小鼠存活情況，6周后處

6、死存活小鼠，收集其外周血和四肢骨的骨髓細(xì)胞，脾、胸腺細(xì)胞。 7.存活小鼠的人源性細(xì)胞表面標(biāo)志分析：流式細(xì)胞儀檢測存活小鼠四肢骨骨髓細(xì)胞的CD45+、CD34+、CD3+、CD19+、CD33+的含量，脾、胸腺細(xì)胞的CD45+、CD34+、CD3+、CDi的含量，抗體按產(chǎn)品說明書方法標(biāo)記上機(jī)檢測。 8.人特異的Cart-Ⅰ基因、Alu基因檢測：提取新鮮臍血細(xì)胞基因組DNA為陽性對照，正常NOD/SCID外周血基因組DNA為

7、陰性對照，β-actine作內(nèi)參照。擴(kuò)增Cart-Ⅰ基因、Alu基因和β-actine基因的反應(yīng)體系和條件相同。擴(kuò)增產(chǎn)物以20g/L瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。 10.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，所有數(shù)據(jù)均采用SPSS10.0軟件分析，統(tǒng)計(jì)方法為ANOVA、chi-squaretest和IndepententSamplesT-test，P＜0.05為顯著性差異。 結(jié)果： 1.不同細(xì)胞因子組合對臍血MNC體外擴(kuò)增

8、的作用：與對照組(A組)相比擴(kuò)增組(B，C組)具有明顯擴(kuò)增優(yōu)勢，尤其C組無論是細(xì)胞總數(shù)，CD34+細(xì)胞含量，CFU數(shù)還是代表HSC和較為早期的HPC的CD34+38-細(xì)胞含量和CFU-GEMM數(shù)均顯著優(yōu)于其他組(P＜0.05)，擴(kuò)增高峰集中于6～10天，d10的細(xì)胞總數(shù)達(dá)9×106個(gè)，CD34+細(xì)胞，CD34+38-細(xì)胞從d0的1.34％，0.99％分別擴(kuò)增至d6的5.45％，3％，CFU和CFU-GEMM也有大幅度增殖，從起始的111

9、個(gè)和113個(gè)擴(kuò)增至d10分別達(dá)到1033和439個(gè)集落的高峰。 2.不同細(xì)胞因子組合對臍血MNC凋亡的影響：含有細(xì)胞因子支持的兩組，細(xì)胞表面AnnexinV的表達(dá)顯著低于對照組，尤其是含有IL-3的C組細(xì)胞在培養(yǎng)后各時(shí)間點(diǎn)的凋亡率均低于A、B兩組，具有顯著差異性(P＜0.05)。 3.存活狀況：空白對照組小鼠均在1周內(nèi)死亡存活率為0，未擴(kuò)增組小鼠存活率33.3％，擴(kuò)增組小鼠存活率55.6％，其余均在移植后2～3周內(nèi)死亡，

10、擴(kuò)增組與未擴(kuò)增組小鼠的6周存活率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。 4.NOD/SCID小鼠中人的造血細(xì)胞植入證據(jù)： 4.1小鼠骨髓、脾和胸腺細(xì)胞中人類白細(xì)胞抗原CD45的表達(dá)：在移植后存活6周的NOD/SCID小鼠骨髓、脾和胸腺細(xì)胞中我們均能檢出人CD45+細(xì)胞，骨髓中擴(kuò)增組(0.42～2.13)％，未擴(kuò)增組(0.1～0.96)％，說明存活的小鼠均獲得臍血造血細(xì)胞的植入，擴(kuò)增組與未擴(kuò)增組無顯著性差異(P＞0.05)。

11、 4.2小鼠外周血細(xì)胞中人Alu基因、Cart-Ⅰ基因的表達(dá)：移植后存活6周的小鼠外周血細(xì)胞與陽性對照相同，擴(kuò)增出224bp和156bp的特異性條帶，表明存在人的造血細(xì)胞。13只存活的NOD/SCID小鼠均能檢測到人的Alu基因、Cart-Ⅰ基因。陰性對照組小鼠未檢測到任何特異性條帶。 5.NOD/SCID小鼠的造血免疫重建：在移植后存活6周的NOD/SCID小鼠骨髓、脾和胸腺細(xì)胞中我們均能檢出人CD33+、CD34+、CD3

12、+、CD19+細(xì)胞，反映人臍血造血細(xì)胞已在小鼠體內(nèi)植入，并開始重建多系造血，其中擴(kuò)增組小鼠骨髓中檢出代表造血干/祖細(xì)胞的人CD34+細(xì)胞、髓系的人CD33+細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞的人CD19+細(xì)胞分別為(0.99±0.65)％、(1.30±0.95)％和(0.64±0.60)％，顯著高于未擴(kuò)增組(P＜0.05)。另外擴(kuò)增組10只存活小鼠中，8只可在胸腺、脾臟中分別檢測到人T細(xì)胞CD3抗原(0.15～1.56)％，人B細(xì)胞CD19抗原(0.03

13、～1.59)％，說明擴(kuò)增的臍血造血細(xì)胞有助于免疫功能重建。 結(jié)論： 1.臍血MNC在無基質(zhì)無血清培養(yǎng)條件下協(xié)同SCF、FL、IL-6和IL-3細(xì)胞因子進(jìn)行短期培養(yǎng)，可實(shí)現(xiàn)有效的體外擴(kuò)增，擴(kuò)增效果以SCF+FL+IL-6+IL-3的組合為最佳。 2.體外擴(kuò)增的6～10天是收獲細(xì)胞的最好時(shí)間。 3.短期培養(yǎng)下IL-3協(xié)同SCF、FL和IL-6有助于減少臍血MNC凋亡。 4.臍血MNC有效擴(kuò)增6天后能成