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文檔簡介
1、臍血以其采集方便、干細(xì)胞含量豐富、GVHD發(fā)生率低而成為造血重建的重要干細(xì)胞來源。但單份臍血所含的造血細(xì)胞數(shù)往往僅能用于兒童和低體重成人患者,臍血的體外擴增有望克服這一障礙,但擴增后臍血造血細(xì)胞的植入能力是否受到影響,造血重建能力能否得以維持是國內(nèi)外學(xué)者和臨床醫(yī)生關(guān)注的熱點。 本實驗室以往的研究證實了以臍血單個核細(xì)胞(MNC)為起始培養(yǎng)細(xì)胞不僅減少細(xì)胞損失簡化實驗操作,而且能夠?qū)崿F(xiàn)有效的擴增,為此我們繼續(xù)探討臍血MNC擴增后移植
2、動物的情況,嘗試尋找一套擴增后臍血應(yīng)用于臨床移植的完整可行方案。目的探討臍血MNC在體外擴增后植入能力的改變以及對NOD/SCID小鼠造血重建的影響,尋找擴增后臍血應(yīng)用于臨床移植的可行方法。 材料與方法: 1.臍血來源:采自足月正常分娩的健康產(chǎn)婦后ACD-A抗凝,共采集10例,均來源廣州醫(yī)學(xué)院附屬廣州市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科和廣東省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科。 2.動物與飼養(yǎng):6~8周齡NOD/SCID小鼠36只,購自中山大學(xué)實
3、驗動物中心,飼養(yǎng)于該中心無特定病原體(SPF)環(huán)境。 3.臍血MNC的分離與液體懸浮培養(yǎng):臍血采集6小時內(nèi)用HES聯(lián)合FicollHypaque密度梯度離心法提取MNC,按1×106/ml接種于含無血清培養(yǎng)基的50ml培養(yǎng)瓶中,在5%CO2,37℃及飽和濕度條件下連續(xù)培養(yǎng)14天。按細(xì)胞因子組合的不同分組如下:A組:空白對照,不加任何細(xì)胞因子;B組:加入SCF、FL和IL6;C組:加入SCF、FL、IL-6和IL-3。分別在培養(yǎng)的
4、0天,6天,10天,14天取出少量細(xì)胞用于計數(shù)細(xì)胞總數(shù),CD34+、CD34+38-細(xì)胞百分含量檢測及CFU、CFU-GEMM集落培養(yǎng)。 4.造血祖細(xì)胞集落培養(yǎng):將細(xì)胞按2×105/ml接種到含甲基纖維素半固體培養(yǎng)基的24孔板中,置5%CO2,37℃及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天,計數(shù)CFU,培養(yǎng)至21天時,計數(shù)CFU-GEMM。 5.凋亡標(biāo)記AnnexinV的檢測:嚴(yán)格按AnnexinV試劑盒說明書操作處理0.5×10
5、5個MNC,流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞的百分率。 6.人臍血細(xì)胞移植NOD/SCID小鼠:36只NOD/SCID小鼠給予250cGy的半致死劑量照射(6WVX射線加速器),照射率300cGy/min,照射后4小時內(nèi)從尾靜脈注入200μl生理鹽水或MNC懸液(含5×106細(xì)胞)。實驗分組:擴增組:18只輸注C組擴增后臍血細(xì)胞;未擴增組:9只輸注等量新鮮臍血MNC;空白對照組:9只輸注200μl生理鹽水。移植后觀察小鼠存活情況,6周后處
6、死存活小鼠,收集其外周血和四肢骨的骨髓細(xì)胞,脾、胸腺細(xì)胞。 7.存活小鼠的人源性細(xì)胞表面標(biāo)志分析:流式細(xì)胞儀檢測存活小鼠四肢骨骨髓細(xì)胞的CD45+、CD34+、CD3+、CD19+、CD33+的含量,脾、胸腺細(xì)胞的CD45+、CD34+、CD3+、CDi的含量,抗體按產(chǎn)品說明書方法標(biāo)記上機檢測。 8.人特異的Cart-Ⅰ基因、Alu基因檢測:提取新鮮臍血細(xì)胞基因組DNA為陽性對照,正常NOD/SCID外周血基因組DNA為
7、陰性對照,β-actine作內(nèi)參照。擴增Cart-Ⅰ基因、Alu基因和β-actine基因的反應(yīng)體系和條件相同。擴增產(chǎn)物以20g/L瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。 10.統(tǒng)計學(xué)分析:實驗數(shù)據(jù)以x±s表示,所有數(shù)據(jù)均采用SPSS10.0軟件分析,統(tǒng)計方法為ANOVA、chi-squaretest和IndepententSamplesT-test,P<0.05為顯著性差異。 結(jié)果: 1.不同細(xì)胞因子組合對臍血MNC體外擴增
8、的作用:與對照組(A組)相比擴增組(B,C組)具有明顯擴增優(yōu)勢,尤其C組無論是細(xì)胞總數(shù),CD34+細(xì)胞含量,CFU數(shù)還是代表HSC和較為早期的HPC的CD34+38-細(xì)胞含量和CFU-GEMM數(shù)均顯著優(yōu)于其他組(P<0.05),擴增高峰集中于6~10天,d10的細(xì)胞總數(shù)達(dá)9×106個,CD34+細(xì)胞,CD34+38-細(xì)胞從d0的1.34%,0.99%分別擴增至d6的5.45%,3%,CFU和CFU-GEMM也有大幅度增殖,從起始的111
9、個和113個擴增至d10分別達(dá)到1033和439個集落的高峰。 2.不同細(xì)胞因子組合對臍血MNC凋亡的影響:含有細(xì)胞因子支持的兩組,細(xì)胞表面AnnexinV的表達(dá)顯著低于對照組,尤其是含有IL-3的C組細(xì)胞在培養(yǎng)后各時間點的凋亡率均低于A、B兩組,具有顯著差異性(P<0.05)。 3.存活狀況:空白對照組小鼠均在1周內(nèi)死亡存活率為0,未擴增組小鼠存活率33.3%,擴增組小鼠存活率55.6%,其余均在移植后2~3周內(nèi)死亡,
10、擴增組與未擴增組小鼠的6周存活率無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。 4.NOD/SCID小鼠中人的造血細(xì)胞植入證據(jù): 4.1小鼠骨髓、脾和胸腺細(xì)胞中人類白細(xì)胞抗原CD45的表達(dá):在移植后存活6周的NOD/SCID小鼠骨髓、脾和胸腺細(xì)胞中我們均能檢出人CD45+細(xì)胞,骨髓中擴增組(0.42~2.13)%,未擴增組(0.1~0.96)%,說明存活的小鼠均獲得臍血造血細(xì)胞的植入,擴增組與未擴增組無顯著性差異(P>0.05)。
11、 4.2小鼠外周血細(xì)胞中人Alu基因、Cart-Ⅰ基因的表達(dá):移植后存活6周的小鼠外周血細(xì)胞與陽性對照相同,擴增出224bp和156bp的特異性條帶,表明存在人的造血細(xì)胞。13只存活的NOD/SCID小鼠均能檢測到人的Alu基因、Cart-Ⅰ基因。陰性對照組小鼠未檢測到任何特異性條帶。 5.NOD/SCID小鼠的造血免疫重建:在移植后存活6周的NOD/SCID小鼠骨髓、脾和胸腺細(xì)胞中我們均能檢出人CD33+、CD34+、CD3
12、+、CD19+細(xì)胞,反映人臍血造血細(xì)胞已在小鼠體內(nèi)植入,并開始重建多系造血,其中擴增組小鼠骨髓中檢出代表造血干/祖細(xì)胞的人CD34+細(xì)胞、髓系的人CD33+細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞的人CD19+細(xì)胞分別為(0.99±0.65)%、(1.30±0.95)%和(0.64±0.60)%,顯著高于未擴增組(P<0.05)。另外擴增組10只存活小鼠中,8只可在胸腺、脾臟中分別檢測到人T細(xì)胞CD3抗原(0.15~1.56)%,人B細(xì)胞CD19抗原(0.03
13、~1.59)%,說明擴增的臍血造血細(xì)胞有助于免疫功能重建。 結(jié)論: 1.臍血MNC在無基質(zhì)無血清培養(yǎng)條件下協(xié)同SCF、FL、IL-6和IL-3細(xì)胞因子進(jìn)行短期培養(yǎng),可實現(xiàn)有效的體外擴增,擴增效果以SCF+FL+IL-6+IL-3的組合為最佳。 2.體外擴增的6~10天是收獲細(xì)胞的最好時間。 3.短期培養(yǎng)下IL-3協(xié)同SCF、FL和IL-6有助于減少臍血MNC凋亡。 4.臍血MNC有效擴增6天后能成
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