丙泊酚通過激活PI3K-Akt-GSK3β信號通路保護(hù)大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用依賴于Caveolin-3的表達(dá).pdf

1、第一部分 Caveolin-3在丙泊酚預(yù)處理后心肌缺血再灌注損傷中的變化趨勢
　　目的：研究caveolin-3在丙泊酚預(yù)處理后心肌缺血再灌注損傷中的變化。方法：建立雄性SD成年大鼠心肌缺血再灌注模型（缺血45min再灌注3h）及H9C2心肌細(xì)胞缺氧再灌注模型（缺氧6h再灌注2h）。本實驗隨機分為四組，n=10：對照組（CONTROL組），缺血再灌注組（SI/R組）或缺氧再灌注組（H/R組），丙泊酚+SI/R或 H/R組（PROP

2、OFOL+SI/R組或 PROPOFOL+H/R組），DMSO+SI/R或 H/R組。PROPOFOL+SI/R組及DMSO+SI/R組分別于缺血（缺氧）前30min給予丙泊酚（在體：37.5mg/kg/h；離體：50umol/L）或DMSO（0.1％）預(yù)處理，再予以缺血再灌注處理。四組標(biāo)本均提取總mRNA，實時定量PCR法檢測caveolin-3的mRNA改變，大鼠心臟EB+TTC染色計算心肌梗死面積百分比，檢測血清LDH水平，冰凍切

3、片TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡指數(shù)，MTT法檢測H9C2心肌細(xì)胞存活率，冰凍切片及H9C2細(xì)胞行caveolin-3熒光染色，Western blotting（WB）法檢測caveolin-3,pPTEN,PTEN，pAkt473,pAkt308,tAkt,pGSK3β，tGSK3β,caspase-3及HIF-1α蛋白表達(dá)量的變化。結(jié)果：DMSO+SI/R組與SI/R組相比，各檢測指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義；PROPOFOL+SI/R組與SI/

4、R組比較，心肌梗死面積百分比減少（32.75±3.70% vs50.31±1.67%,P<0.05），血清LDH水平降低，TUNEL染色示心肌細(xì)胞凋亡率下降（14.68±1.50% vs33.88±2.16%,P<0.002），MTT法示心肌細(xì)胞存活率增加（73.64±2.97% vs61.24±6.52%,P<0.05），WB檢測示caveolin-3表達(dá)量增加（細(xì)胞0.46±0.07 vs0.17±0.04,P<0.01；組織0.9

5、9±0.07 vs0.38±0.07,P<0.002），pAkt473/tAkt、pAkt308/tAkt、pGSK3β/tGSK3β比值均增加（P<0.05），caspase-3表達(dá)減少，HIF-1α表達(dá)增加；與CONTROL組相比，H/R組熒光半定量示caveolin-3膜上分布減少，胞質(zhì)表達(dá)增加（膜蛋白/總蛋白0.09±0.06 vs0.35±0.13,P<0.05），與H/R組相比，PROPOFOL+H/R組caveolin-3

6、膜上表達(dá)量增加（膜蛋白/總蛋白0.33±0.10 vs0.09±0.06,P<0.05）；四組間實時定量PCR示caveolin-3 mRNA水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：心肌缺血再灌注時丙泊酚預(yù)處理可激活 PI3K/Akt/GSK3β信號通路，增加 caveolin-3的膜蛋白表達(dá)量，且不改變其mRNA水平。
　　第二部分 MβCD破壞Caveoae結(jié)構(gòu)后對丙泊酚預(yù)處理在心肌缺氧復(fù)氧損傷保護(hù)作用中的影響
　　目的探討用MβC

7、D破壞caveolae結(jié)構(gòu)對丙泊酚預(yù)處理所致心肌缺氧復(fù)氧損傷保護(hù)作用的影響。方法甲基倍他環(huán)糊精（MβCD）可破壞caveolae結(jié)構(gòu)，于丙泊酚或DMSO給藥前30min給予10mmol/L MβCD處理，觀察caveolin-3結(jié)構(gòu)破壞后對丙泊酚預(yù)處理所致心肌保護(hù)作用及PI3K/Akt/GSK3β通路的影響。將H9C2心肌細(xì)胞接種后隨機分為8組，n=5：CONTROL組，H/R組，PROPOFOL+H/R組，DMSO+H/R組，MβCD

8、+CONTROL組，MβCD+H/R組，MβCD+PROPOFOL+H/R組，MβCD+DMSO+H/R組。MTT法比較各組間細(xì)胞存活率，同時 WB檢測 caveolin-3，pAkt473,pAkt308,tAkt,pGSK3β,tGSK3β蛋白表達(dá)情況。結(jié)果用MβCD破壞caveolae結(jié)構(gòu)后，MβCD+CONTROL組與CONTROL組、MβCD+H/R組與H/R組、MβCD+DMSO+H/R與 DMSO+H/R組比較，細(xì)胞存活率

9、差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；與PROPOFOL+H/R組相比，MβCD+PROPOFOL+H/R組細(xì)胞存活率下降（57.68±12.91%vs83.19±4.44%,P<0.002）；WB結(jié)果顯示，與CONTROL組相比，MβCD+CONTROL組caveolin-3表達(dá)減少（0.16±0.03 vs0.81±0.09,P<0.002），pAkt473/tAkt、pAkt308/tAkt、pGSK3β/tGSK3β比值均減少（P<0.05）；與

10、 PROPOFOL+H/R組相比，MβCD+PROPOFOL+H/R組caveolin-3表達(dá)減少（0.24±0.05 vs0.70±0.14,P<0.01），pAkt473/tAkt、 pAkt308/tAkt、 pGSK3β/tGSK3β比值減少(P<0.05)。結(jié)論 MβCD破壞caveolae結(jié)構(gòu)后，caveolin-3表達(dá)減少，PI3K/Akt/GSK3β信號通路蛋白磷酸化水平下降，丙泊酚預(yù)處理所致心肌缺氧復(fù)氧損傷保護(hù)作用減弱

11、。
　　第三部分通過抑制Caveolin-3降解觀察其對PI3K/Akt/GSK3β信號通路的影響
　　目的研究心肌缺氧復(fù)氧時caveolin-3的降解被抑制后，丙泊酚預(yù)處理對缺氧復(fù)氧損傷保護(hù)作用的影響。方法蛋白體酶抑制劑MG132可抑制caveolin-3的降解，含MG132組各組給予20umol/L MG132處理30min，觀察其對caveolin-3、PI3K/Akt/GSK3β信號通路及細(xì)胞存活率的影響。將H9C2

12、心肌細(xì)胞接種后分為5組，n=5： CONTROL組，H/R組，PROPOFOL+H/R組，MG132+H/R組，MG132+PROPOFOL+H/R組。WB檢測 caveolin-3,pAkt473,pAkt308,tAkt,pGSK3β，tGSK3β蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 WB結(jié)果示，與H/R組相比，MG132+H/R組caveolin-3表達(dá)明顯增加（1.00±0.12 vs0.49±0.11,P<0.01），pAkt473/tAkt、

13、pAkt308/tAkt、pGSK3β/tGSK3β比值增加(P<0.05)，同時細(xì)胞生存率增加（P<0.05）；與PROPOFOL+H/R組相比，MG132+PROPOFOL+H/R組各蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義、細(xì)胞存活率組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論心肌缺血再灌注時caveolin-3的下降與其經(jīng)蛋白體酶途徑降解增多有關(guān)，并且 caveolin-3表達(dá)量的變化影響PI3K/Akt/GSK3β信號通路各蛋白表達(dá)水平；丙泊酚對心肌缺氧復(fù)氧