使用熒光納米材料實時跟蹤技術可視化研究病毒與細胞相互作用.pdf

1、病毒與宿主細胞蛋白的相互作用一直以來是病毒學界的研究熱點。例如在丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)的研究中，科研工作者通過建立HCV的細胞模型(亞基因組復制子模型和全長基因組復制子模型)來研究細胞與病毒的相互作用，研究發(fā)現(xiàn)了兩個十分重要的抗病毒藥物設計靶點即NS3絲氨酸蛋白酶以及NS5BRNA依賴性RNA聚合酶。
　　 但所有類似的研究都需要基于一定的方法和策略。在SV40與Vero細胞的研究中使用諸如M

2、βCD、nocodazole等藥物并結合細胞器染色技術來研究病毒與細胞相互作用機理。而近年來使用化學發(fā)光試劑標記病毒衣殼蛋白或假病毒粒子(virus-like particles，VLPs)以研究病毒與細胞相互作用則是很有應用前景的新方法。
　　 本研究基于我們實驗室研究平臺并結合化學領域中新合成的發(fā)光納米材料(例如量子點，“光開關”等)的優(yōu)勢，研究兩種無囊膜的病毒即兔出血熱病毒(rabbithemorrhagic diseas

3、e virus,RHDV)和人類博卡病毒(Human Bocavirus，HBoV)主要衣殼蛋白在昆蟲細胞中形成的VLPs與Sf9(Spodoptera frugiperda)、RK13(rabbit kidney13)以及豬細小病毒(porcine parvovirus，PPV)與豬精細胞(porcine testis，PT)的相互作用，進而揭示病毒在細胞中的運動途徑，闡明病毒與宿主細胞的相互作用機制，并根據(jù)這些數(shù)據(jù)來探索建立一個病毒

4、與細胞相互作用的一般研究方法。其完成的工作包括以下幾個方面：
　　 1.表達并純化出兔出血熱病毒RHDV衣殼蛋白VP60;
　　 1)將RHDV衣殼蛋白基因VP60插入到pMAL-c2X載體，獲得重組質粒pMAL-VP60并在大腸桿菌DH5α中表達VP60蛋白，經(jīng)SDS-PAGE及Western Blot檢測后，擴大培養(yǎng)并利用Amylose親和層析柱純化VP60蛋白。并將純化出的VP60蛋白嘗試在體外控制條件下使其自組裝

5、成VLPs。
　　 2)使用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)在High-Five cell(Hi-5)昆蟲細胞中表達VP60蛋白。重組Bacmid感染Sf9并使用MOI為5～10的病毒再感染Hi-5細胞以表達VP60-VLPs，然后使用蔗糖及CsCl梯度離心獲得較純凈的VLPs，電鏡觀察。
　　 2.表達并純化HBoV衣殼蛋白VP2;
　　 1)將HBoV衣殼蛋白基因VP2插入到PET-28(a)載體，獲得重