中藥“復(fù)方人參飲”抗小鼠酒精成癮作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，研究中藥湯劑“復(fù)方人參飲”對(duì)酒精成癮模型小鼠的抗成癮作用，并在此基礎(chǔ)上初步探討其作用機(jī)制。希望為酒精成癮的治療與防治提供新的思路并以期為臨床提供安全有效的理想抗成癮藥物。
　　方法：①條件位置偏愛(ài)模型實(shí)驗(yàn)方法。CPP主要應(yīng)用于評(píng)價(jià)藥物的正性強(qiáng)化作用，廣泛應(yīng)用于藥物成癮的精神依賴評(píng)價(jià)，本實(shí)驗(yàn)包括3個(gè)階段：第一階段：適應(yīng)期（-3--1天），SPF級(jí)昆明種小鼠，雄性，25g±5g，將小鼠放入 CPP箱中,由中間

2、箱放入，打開(kāi)閘門(mén)讓其自由穿梭15分鐘，每天一次，連續(xù)3天，第3天記錄小鼠在黑、白中間箱中停留的時(shí)間,同時(shí)剔除對(duì)箱體某一側(cè)有顯著偏愛(ài)的小鼠（在一側(cè)停留的時(shí)間>650S）以排除非條件性位置偏愛(ài)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,結(jié)果表明幾乎所有小鼠偏愛(ài)黑箱,由此將白箱作為伴藥側(cè)。第二階段：形成期（1-10天），適應(yīng)期結(jié)束后,小鼠隨機(jī)分成4個(gè)組，每組12只；鹽水組對(duì)照、模型組（酒精）、中藥組（復(fù)方人參飲）、實(shí)驗(yàn)組（復(fù)方人參飲+酒精）。每只小鼠每天接受一次訓(xùn)練，

3、酒精每隔一天給藥一次。具體為，若第一天灌胃酒精（2.2/kg），放入伴藥箱訓(xùn)練15分鐘，第二天則灌胃相同體積的生理鹽水，非伴藥箱訓(xùn)練15分鐘。依次類推，5個(gè)酒精/鹽水訓(xùn)練周期。訓(xùn)練前小鼠灌胃鹽水或復(fù)方人參飲(1.8g/kg),30分鐘后灌胃生理鹽水或酒精(2.2g/kg),5分鐘后放入相應(yīng)的訓(xùn)練箱內(nèi)訓(xùn)練15分鐘。第三階段：測(cè)試期限（11）天:測(cè)試當(dāng)天不給藥，放入 CPP箱中測(cè)試15分鐘，記錄小鼠在各箱的停留時(shí)間。②行為敏化動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)

4、方法。行為敏化（Behavioral Sensitization)是指反復(fù)間斷給予依賴性藥物如（嗎啡、甲基苯丙胺、可卡因、酒精等），動(dòng)物會(huì)對(duì)依賴性藥物行為效應(yīng)增加。行為敏化是動(dòng)物成癮的主要特征之一，與強(qiáng)迫性覓藥，戒斷后的復(fù)飲行為關(guān)系密切[2]，現(xiàn)已作為精神與行為依賴的重要?jiǎng)游锬Ｐ捅粡V泛應(yīng)用。行為敏化的實(shí)驗(yàn)過(guò)程：適應(yīng)期：小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，期間稱重所有的實(shí)驗(yàn)小鼠，灌胃等量的生理鹽水后立即放入自主活動(dòng)測(cè)試儀中，使小鼠能夠適應(yīng)測(cè)試實(shí)驗(yàn)環(huán)境，時(shí)

5、間為15分鐘。第7天適應(yīng)后，所有的小鼠放入自主活動(dòng)測(cè)試儀中測(cè)試小鼠的自主活動(dòng)基線，隨后被隨機(jī)分為4個(gè)大組。形成期：在測(cè)試自主活動(dòng)基線后，小鼠在半小時(shí)之前灌胃中藥(1.8g/kg)或者鹽水，隨后灌胃（2.2 g/kg）的酒精或者生理鹽水，即形成鹽水組+鹽水組（S+S組，n=40），中藥組+鹽水組（Z+S，n=40），鹽水組+酒精組（S+E，n=40），中藥組+酒精組（Z+E,n=40）在酒精或者生理鹽水灌胃5min后立即放入測(cè)試儀中測(cè)試1

6、5分鐘，實(shí)驗(yàn)隔天進(jìn)行一次，總共10天、進(jìn)行5次。激發(fā)期：每個(gè)實(shí)驗(yàn)大組，再次被組內(nèi)隨機(jī)分成4個(gè)亞組。藥物激發(fā)階段小鼠分別接受酒精、中藥、中藥+酒精，鹽水的激發(fā)，5min后立即放入自主活動(dòng)測(cè)試儀中，測(cè)試15分鐘。測(cè)試完成后，將鹽水+鹽水+酒精組（n=10），鹽水+酒精組+酒精組（s+e+e，n=10）小鼠，鹽水+酒精組+中藥組+酒精組（s+e+z+e，n=10）小鼠，中藥組+酒精組+酒精組（s+e+e，n=10）小鼠，這4個(gè)亞組的小鼠立即斷

7、頭處死，取腦組織，檢測(cè)中腦邊緣腹側(cè)被蓋區(qū)（VTA）及其投射區(qū)伏隔核的（NAC）的多巴胺(DA)，海馬區(qū)、杏仁核區(qū)的谷氨酸（GLU），腹側(cè)被蓋區(qū)（VTA）和NAC區(qū)的γ-氨基丁酸（GABA）這3個(gè)神經(jīng)遞質(zhì)中藥干預(yù)前后的變化。
　　結(jié)果：⑴本次實(shí)驗(yàn)適應(yīng)階段的天然偏愛(ài)測(cè)試結(jié)果顯示，大多數(shù)小鼠顯著天然偏愛(ài)于黑色箱，在黑箱與白箱停留的時(shí)間分別為609.97士4..466（S），265.75士67.686（s）(P<0.01)，故本次實(shí)驗(yàn)選擇

8、白色為伴藥箱側(cè)，黑色為非伴藥箱測(cè)。⑵在測(cè)試階段的結(jié)果顯示，復(fù)方人參飲組與鹽水組相比不影響小鼠的天然位置偏愛(ài)選擇，中藥組在伴藥箱測(cè)停留時(shí)間為249.58±20.585,鹽水組為268.33.士41.033（P>0.05），提示其中藥本身不具獎(jiǎng)賞效應(yīng)即沒(méi)有精神依賴性。⑶在測(cè)試期，小鼠經(jīng)訓(xùn)練后，酒精模型組（2.2g/kg）與鹽水對(duì)照組相比，在白色伴藥箱停留的時(shí)間分別為595.33±57.917，268.33.士41.033（p<0.01），兩

9、者具有顯著差異性，提示酒精對(duì)小鼠具有正性獎(jiǎng)賞效應(yīng)，能夠誘導(dǎo)小鼠條件位置偏愛(ài)模型的形成。⑷“復(fù)方人參飲”+酒精組與酒精組相比，兩組在測(cè)試期伴藥箱測(cè)停留的時(shí)間分別為303.67±48.543（S），595.33±57.917(S)(P<0.01),能夠顯著減少實(shí)驗(yàn)小鼠在白色伴藥箱停留的時(shí)間，證明中藥“復(fù)方人參飲”對(duì)由酒精誘導(dǎo)的小鼠條件位置偏愛(ài)模型的形成具有干預(yù)作用，提示中藥“復(fù)方人參飲”能夠干預(yù)酒精介導(dǎo)的正性獎(jiǎng)賞作用。⑸中藥“復(fù)方人參飲”干

10、預(yù)組能夠時(shí)程相關(guān)性的干預(yù)酒精誘導(dǎo)的小鼠條件位置偏愛(ài)模型的形成，在三個(gè)測(cè)試期（session1、session2、session3），復(fù)方人參飲+酒精組與酒精模型組兩組在白色伴藥箱停留的時(shí)間分別為（265.75±53.654、265.75±53.654、336.33±39.910，341.58±28.3340，492.83±60.4045，603.67±50.0190）（P<0.05）。⑹適應(yīng)期各組小鼠的活動(dòng)基線沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。（P>0.

11、05）。⑺10天5次測(cè)試期間，鹽水組，中藥組，酒精組（2.2g/kg），中藥+酒精組各組之間自主活動(dòng)的比較：結(jié)果顯示，中藥組與鹽水對(duì)照組之間小鼠的自主活動(dòng)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），提示中藥“復(fù)方人參飲”本身對(duì)小鼠的自主活動(dòng)并沒(méi)有影響。酒精模型組與鹽水組對(duì)照組相比在5次測(cè)試期間小鼠的自主活動(dòng)具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）,提示酒精組小鼠的自主活動(dòng)明顯高于鹽水對(duì)照組，酒精能夠引起小鼠的高活動(dòng)性。中藥+酒精組與酒精模型組相比，在第

12、2、3、4、5次測(cè)試期小鼠的自主活動(dòng)次數(shù)明顯低于酒精模型組，提示在酒精灌胃之前，予以中藥“復(fù)方人參飲”能夠減少酒精誘導(dǎo)的小鼠自主活動(dòng)次數(shù)，即說(shuō)明“復(fù)方人參飲”對(duì)酒精誘導(dǎo)的小鼠行為敏化的形成過(guò)程具有抑制作用。⑻復(fù)方人參飲對(duì)酒精誘導(dǎo)的小鼠行為敏化形成期與表達(dá)期的影響：中藥“復(fù)方人參飲”組，在分別由酒精，中藥，中藥+酒精，鹽水的激發(fā)下與鹽水對(duì)照組相比并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），提示“復(fù)方人參飲”本身對(duì)小鼠的行為敏化的形成與表達(dá)并不起作用

13、。⑼酒精誘導(dǎo)的小鼠行為敏化：酒精模型組（2.2g/kg）接受酒精激發(fā)之后，與鹽水激發(fā)相比小鼠的自主活動(dòng)表現(xiàn)差異性顯著（P<0.01），表明酒精誘導(dǎo)的小鼠行為敏化動(dòng)物模型已經(jīng)建立。⑽中藥“復(fù)方人參飲”對(duì)酒精誘導(dǎo)的小鼠行為敏化模型形成的影響：中藥+酒精組在酒精激發(fā)之后與鹽水組并不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），提示在經(jīng)過(guò)10天的中藥“重復(fù)”給藥，中藥“復(fù)方人參飲”對(duì)小鼠的行為敏化成癮機(jī)制的形成具有顯著的干預(yù)作用。⑾中藥“復(fù)方人參飲”對(duì)小鼠行

14、為敏化表達(dá)的影響：在小鼠予以酒精激發(fā)之前半小時(shí)，我們予以中藥“復(fù)方人參飲”灌胃，結(jié)果顯示與單純酒精激發(fā)組相比，中藥+酒精組對(duì)小鼠行為敏化的激發(fā)具有顯著的作用，兩組存在顯著差異性（P<0.01），即證明中藥“復(fù)方人參飲”對(duì)小鼠酒精的戒斷之后的復(fù)吸有一定作用。⑿中藥“復(fù)方人參飲”對(duì)由酒精誘導(dǎo)的小鼠行為敏化動(dòng)物模型形成期、表達(dá)期多巴胺（DA）、谷氨酸(GLU)、γ一氨基丁酸(GABA)神經(jīng)遞質(zhì)含量影響的變化：在由酒精誘導(dǎo)的小鼠行為敏化的形成期

15、與表達(dá)期，酒精成癮組小鼠多巴胺（DA），谷氨酸(GLU)水平與鹽水對(duì)照組相比顯著增高（P<0.01）,而中藥“復(fù)方人參飲”干預(yù)組與酒精成癮組相比，多巴胺（DA），谷氨酸(GLU)，水平明顯減少（P<0.01）。表明中藥“復(fù)方人參飲”干預(yù)組能夠減少多巴胺（DA）、谷氨酸(GLU)的釋放。同樣的，通過(guò)對(duì)γ一氨基丁酸(GABA)的組間比較我們發(fā)現(xiàn)，在行為敏化形成期與表達(dá)期，模型組小鼠γ一氨基丁酸(GABA)的含量與鹽水對(duì)照組相比明顯減少（P<

16、0.01），中藥“復(fù)方人參飲”干預(yù)組與模型組相比，γ一氨基丁酸(GABA)的含量呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)（P<0.01），表明中藥“復(fù)方人參飲”能夠促進(jìn)成癮小鼠γ一氨基丁酸(GABA)的釋放。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明“復(fù)方人參飲”本身沒(méi)有致依賴潛力，不能影響成癮機(jī)制的形成及發(fā)展。至關(guān)重要的是“復(fù)方人參飲”可有效干預(yù)由酒精誘導(dǎo)的小鼠條件位置偏愛(ài)（CPP）及行為敏化動(dòng)物模型的形成與表達(dá)，即中藥“復(fù)方人參飲”能夠?qū)凭砂a患者心理依賴、