中藥復(fù)方熱毒平抗中暑內(nèi)毒素血癥作用及其機(jī)制探討.pdf

1、研究背景 中暑是人體在高溫和熱輻射長(zhǎng)期作用下，和(或)因?yàn)檫^(guò)強(qiáng)體力勞動(dòng)使產(chǎn)熱量大大超過(guò)機(jī)體散熱能力，導(dǎo)致機(jī)體體溫調(diào)節(jié)中樞障礙、水鹽代謝紊亂、循環(huán)衰竭和腦膜、腦組織受損所引起的一組急性過(guò)熱性疾病的總稱[1]。它是我國(guó)南方夏季作業(yè)、軍事訓(xùn)練和作戰(zhàn)等情況中的常見病和多發(fā)病，熱射病是其中最嚴(yán)重的一型，死亡率高達(dá)17-80％[2]，一旦發(fā)生，病程十分兇險(xiǎn)，生還可能性極小。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，僅2004年夏季廣東省死于中暑的人數(shù)就達(dá)到50余人。由

2、于中暑嚴(yán)重影響人民群眾身體健康和部隊(duì)?wèi)?zhàn)斗力，因此對(duì)它的防治一直都是預(yù)防醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)。中暑的病理生理學(xué)過(guò)程復(fù)雜，至今沒(méi)有完全闡明[3]，近年來(lái)，腸源性內(nèi)毒素血癥在中暑發(fā)病過(guò)程中的重要作用及對(duì)預(yù)后的影響正逐漸受到醫(yī)學(xué)界關(guān)注[4]。根據(jù)該理論，在中暑發(fā)病過(guò)程中使用抗內(nèi)毒素藥物將對(duì)中暑治療起到積極作用。中藥復(fù)方制劑熱毒平是以治療發(fā)熱內(nèi)毒素血癥為目標(biāo)研制的藥物，體外能直接滅活內(nèi)毒素并能拮抗內(nèi)毒素對(duì)小鼠的致死性攻擊，同時(shí)具有一定的抗菌、抗病毒功效

3、[5]，將其應(yīng)用于中暑防治有望取得積極效果。 目的 本研究通過(guò)建立中暑內(nèi)毒素血癥動(dòng)物模型，從熱毒平治療中暑內(nèi)毒素血癥效果入手，進(jìn)而探討其起效機(jī)制，為該類藥物在中暑內(nèi)毒素血癥治療方面的應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為重癥中暑防治提供新的切入點(diǎn)。 方法 首先觀察熱毒平對(duì)中暑內(nèi)毒素血癥動(dòng)物模型的治療效果。在干球溫度(34.5±0.5)℃，相對(duì)濕度(60±5)％的條件下建立小鼠中暑內(nèi)毒素血癥模型，將32只小鼠隨機(jī)分為

4、熱毒平組、西黃芪膠組、高溫對(duì)照組和地塞米松組，每組8只，給藥前0.5h，測(cè)量小鼠肛溫作為基礎(chǔ)體溫。給藥劑量、方法按文獻(xiàn)[6]報(bào)道，熱毒平組為5g/kg體重灌胃；西黃芪膠組給予等體積的西黃芪膠液灌胃，地塞米松組皮下注射地塞米松0.005g/kg體重。給藥半小時(shí)后，將5組同時(shí)放入人工熱氣候模擬艙，熱暴露直至死亡。每半小時(shí)記錄小鼠的肛溫，觀察小鼠肛溫上升速率、存活時(shí)間及三小時(shí)死亡率。其次是對(duì)熱毒平抗中暑內(nèi)毒素血癥機(jī)制進(jìn)行探討。 結(jié)果

5、 1.應(yīng)用熱毒平后中暑小鼠生理指標(biāo)變化熱毒平組小鼠的肛溫上升速率慢于地塞米松組、西黃芪膠組和高溫對(duì)照組，四組數(shù)據(jù)分別為0.023℃/min、0.048℃/min、0.030℃/min和0.043℃/min(P＜0.05)；存活時(shí)間較其他三組動(dòng)物明顯延長(zhǎng)，數(shù)據(jù)分別為198.88min、113.88min、164.63min和125.63min(P＜0.05)；3h死亡率為25％，顯著低于其他三組的100％、75％、75％(P＜0.0

6、5)。 2.血漿中內(nèi)毒素含量變化熱暴露2h后，西黃芪膠組、生理鹽水組、高溫對(duì)照組小鼠血漿內(nèi)毒素含量分別為0.234±0.008ng/ml，0.237±0.004ng/ml和0.230±0.012ng/ml，較正常對(duì)照組0.116±0.005ng/ml明顯升高(P＜0.05)。而熱毒平組小鼠血漿內(nèi)毒素含量為0.120±0.006ng/ml，略高于正常對(duì)照組，但無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 3.血漿中TNF-α含量變化西黃

7、芪膠組、生理鹽水組和高溫對(duì)照組小鼠血漿TNF-α含量分別為211.26±7.17pg/ml、205.91±16.01pg/ml和227.64±12.02pg/ml，較正常對(duì)照組51.81±2.53pg/ml有明顯的升高，差異具有顯著性(P＜0.05)。而熱毒平組為54.25±1.63pg/ml，比正常對(duì)照組略有升高，但升高幅度較小，無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。西黃芪膠組、生理鹽水組和高溫對(duì)照組組間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，而熱毒平

8、組與此三組相比均有顯著性差異(P＜0.05)。 4.腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力變化中性紅法顯示熱毒平組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的能力明顯高于西黃芪膠組、生理鹽水組和高溫對(duì)照組(P＜0.05)，略高于正常對(duì)照組(P＞0.05)，以上五組的光密度值分別為0.473±0.045、0.233±0.030、0.262±0.029、0.261±0.029和0.465±0.039。但西黃芪膠組、生理鹽水組和高溫對(duì)照組之間以及熱毒平組與正常對(duì)照組之

9、間的差異沒(méi)有顯著性(P＞0.05)。雞紅細(xì)胞法的結(jié)果與中性紅法相似，熱毒平組小鼠的巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)明顯高于西黃芪膠組、生理鹽水組和高溫對(duì)照組(P＜0.05)，略高于正常對(duì)照組(P＞0.05)，而西黃芪膠組、生理鹽水組和高溫對(duì)照組之間以及熱毒平組與正常對(duì)照組之間的差異沒(méi)有顯著性(P＞0.05)。 5.血漿和肝組織脂質(zhì)過(guò)氧化水平變化熱毒平組小鼠血漿中SOD活力高于西黃芪膠組、生理鹽水組和高溫對(duì)照組(P＜0.05

10、)，與正常對(duì)照組相近(P＞0.05)，數(shù)值為138.35±20.85U/ml、76.42±4.49U/ml、77.87±5.13U/ml、76.33±5.50U/ml和112±10.43U/ml。MDA含量則明顯低于其它三組(P＜0.05)，略低于正常對(duì)照組(P＞0.05)，五組分別為5.45±0.39nmol/ml、7.74±0.42nmol/ml、7.66±0.48nmol/ml、7.75±0.37nmol/ml和5.80±0.53

11、nmol/ml。肝組織中SOD活力、MDA含量也顯示了同樣的趨勢(shì)，熱毒平組的SOD活力為115.59±12.81U/ml，遠(yuǎn)高于西黃芪膠組69.46±9.34U/ml、生理鹽水組70.46±4.00U/ml和高溫對(duì)照組30.43±7.83U/ml(P＜0.05)，與正常對(duì)照組122.09±14.77U/ml相近(P＞0.05)，而熱毒平組小鼠肝組織中MDA含量較熱暴露的其它三組低(P＜0.05)，與正常對(duì)照組相近。具體數(shù)值為：熱毒平組7

12、.84±0.045nmol/mgprot、西黃芪膠組8.96±0.38nmol/mgprot、生理鹽水組8.72±0.11nmol/mgprot、高溫對(duì)照組9.14±0.07nmol/mgprot和正常對(duì)照組7.79±0.07nmol/mgprot。 6.腹腔巨噬細(xì)胞凋亡情況變化AO能夠進(jìn)入正常細(xì)胞的細(xì)胞膜，與DNA結(jié)合呈綠色或黃綠色熒光，與RNA結(jié)合呈桔黃色熒光，而EB只能進(jìn)入膜受損的細(xì)胞，與DNA結(jié)合呈橙紅色熒光。AO/EB

13、熒光雙重染色結(jié)果示：熱毒平組細(xì)胞，胞核大多呈均勻的綠色熒光，有極少量橙紅色的凋亡細(xì)胞，與正常對(duì)照組相近，而西黃芪膠組、生理鹽水組和高溫對(duì)照組均出現(xiàn)大量中、晚期的凋亡細(xì)胞和少量的死亡細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測(cè)示，與正常對(duì)照組相比，西黃芪膠組、生理鹽水組和高溫對(duì)照組腹腔巨噬細(xì)胞的凋亡率顯著升高，熱毒平組凋亡率雖有升高，但升幅不大，與正常對(duì)照組相近(P＞0.05)，而與其它三組有顯著性差異(P＜0.05)。 7.腹腔巨噬細(xì)胞TLR4mRNA

14、和NF-кBmRNA表達(dá)變化西黃芪膠組、生理鹽水組、高溫對(duì)照組TLR4mRNA的表達(dá)水平明顯的高于正常對(duì)照組和熱毒平組(P＜0.05)，熱毒平組的表達(dá)水平略高于正常對(duì)照組，但無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。而NF-кBmRNA的表達(dá)水平顯示了同樣的規(guī)律，即西黃芪膠組、生理鹽水組、高溫對(duì)照組NF-кBmRNA的表達(dá)水平明顯的高于正常對(duì)照組和熱毒平組(P＜0.05)，而正常對(duì)照組和熱毒平組之間沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)。 8.肝臟

15、組織結(jié)構(gòu)變化肝臟病理切片觀察到西黃芪膠組、生理鹽水組、高溫對(duì)照組肝組織大量的充血，細(xì)胞核腫脹，中央靜脈擴(kuò)張，可見大量的氣泡，而熱毒平組肝組織僅見少量的充血和胞核腫脹，未見氣泡，與正常對(duì)照組相近。電鏡示西黃芪膠組、生理鹽水組、高溫對(duì)照組肝細(xì)胞核變形、不規(guī)則，線粒體腫脹，嵴減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，呈空泡狀，溶酶體增多，部份細(xì)胞出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。而熱毒平組肝細(xì)胞細(xì)胞核基本正常，線粒體、嵴正常，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無(wú)腫脹，細(xì)胞形態(tài)與正常組相近。 結(jié)論

16、1.熱毒平是一種治療中暑的有效藥物，它能減緩中暑小鼠肛溫上升速率、延長(zhǎng)生存時(shí)間、降低死亡率，減輕肝臟等重要臟器病理?yè)p傷，對(duì)中暑小鼠機(jī)體損傷具有良好保護(hù)作用。 2.熱毒平能夠顯著降低中暑小鼠血中內(nèi)毒素含量，減少由內(nèi)毒素誘導(dǎo)的重要細(xì)胞因子TNF-α的分泌，即能有效抑制內(nèi)毒素血癥對(duì)機(jī)體的嚴(yán)重?fù)p害，進(jìn)而達(dá)到治療中暑目的。此亦顯示抗中暑內(nèi)毒素血癥應(yīng)是其治療中暑的主要起效機(jī)制之一。 3.熱毒平通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞能量代謝等方法，提高巨噬細(xì)胞

17、吞噬能力，使機(jī)體能夠有效清除產(chǎn)生的內(nèi)毒素，降低血中內(nèi)毒素含量，間接拮抗內(nèi)毒素引起的繼發(fā)性損傷，此應(yīng)是其抗中暑內(nèi)毒素血癥重要機(jī)制之一。 4.熱毒平能減輕中暑小鼠血液和組織脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，抑制腹腔巨噬細(xì)胞凋亡。該藥物能提高中暑小鼠血液和組織SOD活力，降低MDA含量，此舉能有效抑制內(nèi)毒素血癥導(dǎo)致的脂質(zhì)過(guò)氧化對(duì)肝臟等重要臟器的損傷，同時(shí)熱毒平能抑制腹腔巨噬細(xì)胞凋亡，保護(hù)巨噬細(xì)胞功能，增強(qiáng)其殺滅內(nèi)毒素的能力。故減輕中暑小鼠血液和組織脂質(zhì)