氨基胍對(duì)缺血再灌注腎損傷小鼠的保護(hù)作用及可能機(jī)制.pdf

1、缺血再灌注損傷(ischemic reperfusion injury，IRI)是指組織或器官在缺血及重獲血流灌注或氧供應(yīng)后，對(duì)組織或器官產(chǎn)生的損傷作用。腎是高灌注器官，對(duì)缺血缺氧較為敏感，因此腎缺血一再灌注損傷在臨床上較為常見。研究表明，腎缺血一再灌注損傷是引起急性腎衰竭（acute renal failure，ARF）和慢性腎衰竭(chronic renal failure，CRF)的主要原因。但是缺血再灌注腎損傷的發(fā)病機(jī)制至今尚未

2、完全闡明。因此，明確腎缺血一再灌注損傷的發(fā)病機(jī)理，尋求緩解損傷或者治療方法成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。
　　 研究表明缺血再灌注腎損傷的發(fā)生與ATP減少、大量氧自由基(Oxygen free radical，OFR)產(chǎn)生、細(xì)胞內(nèi)鈣超載和細(xì)胞凋亡基因調(diào)控等介導(dǎo)的腎小管和腎小球細(xì)胞損傷的關(guān)系密切。亦有研究顯示誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)在腎缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用，但其具

3、體作用目前尚存在爭(zhēng)議。有研究表明，降低iNOS表達(dá)可以減輕缺血再灌注損傷，而另一些研究則認(rèn)為提高iNOS表達(dá)能減輕缺血再灌注損傷。為進(jìn)一步探討腎缺血再灌注損傷與iNOS的關(guān)系，我們構(gòu)建了小鼠缺血再灌注腎損傷模型，通過(guò)real-time PCR和免疫組織化學(xué)方法對(duì)比iNOS mRNA和蛋白在假手術(shù)組和缺血再灌注組小鼠表達(dá)的差異，同時(shí)給予缺血再灌注腎損傷小鼠術(shù)前應(yīng)用iNOS特異性抑制劑AG并對(duì)比腎損傷程度，以期明確腎缺血再灌注損傷和iNOS

4、的關(guān)系并尋求治療方法。本研究主要由以下三部分內(nèi)容組成。
　　 一、小鼠缺血再灌注腎損傷模型的建立。
　　 為研究缺血再灌注腎損傷的發(fā)生機(jī)理，我們制作了小鼠缺血再灌注腎損傷模型。制作腎IRI動(dòng)物模型的方法包括雙側(cè)腎蒂夾閉、雙側(cè)腎動(dòng)脈夾閉、單側(cè)腎切除+對(duì)側(cè)腎動(dòng)脈夾閉等。本實(shí)驗(yàn)是通過(guò)雙側(cè)腎蒂夾閉法制作小鼠缺血再灌注模型。通過(guò)參閱相關(guān)文獻(xiàn)及多次預(yù)實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)手術(shù)方法不同、血管夾閉的時(shí)間長(zhǎng)短、術(shù)中溫度的控制、鼠齡等均對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有

5、重要影響，尤其是術(shù)中溫度和夾閉腎蒂的時(shí)間在此過(guò)程中起著不可忽視的作用。經(jīng)過(guò)不斷摸索，多次檢測(cè)造模24小時(shí)后尿素氮、肌酐水平，我們最終確定術(shù)中溫度37℃，雙側(cè)腎蒂夾閉45分鐘為制作本模型的必需條件。
　　 二、小鼠缺血再灌注腎損傷對(duì)iNOS的影響。
　　 一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)是一氧化氮(oxide synthase，NO)生物合成的關(guān)鍵限速酶，可催化L-精氨酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-胍氨酸和

6、NO。主要包括神經(jīng)元型NOS、內(nèi)皮型NOS和iNOS。病理狀態(tài)下，iNOS可被細(xì)胞因子、創(chuàng)傷等誘導(dǎo)表達(dá)并催化產(chǎn)生大量NO，引起體內(nèi)一系列病理生理變化，導(dǎo)致組織器官損傷。但是iNOS在缺血再灌注損傷中的作用一直存在爭(zhēng)議。本研究通過(guò)建立小鼠缺血再灌注腎損傷模型，造模24小時(shí)后提取小鼠腎組織mRNA進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)iNOS mRNA的變化情況并通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)比小鼠缺血再灌注腎損傷后iNOS蛋白表達(dá)水平的變化情況，結(jié)果

7、發(fā)現(xiàn)缺血再灌注腎損傷后小鼠iNOS mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯增加，提示iNOS增高可能是引起小鼠缺血再灌注腎損傷的發(fā)病機(jī)理之一。
　　 三、氨基胍（aminoguanidine，AG）對(duì)缺血再灌注腎損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。
　　 氨基胍是一類胍類化合物，可特異性抑制iNOS活性，減少NO生成。本研究發(fā)現(xiàn)術(shù)前注射AG（50mg/Kg）可明顯降低缺血再灌注腎損傷后的iNOS mRNA和蛋白的表達(dá)水平，減輕腎損傷程度（尿素氮

8、、肌酐水平降低）。究其原因可能是AG特異性抑制iNOS的表達(dá)，減少其催化產(chǎn)生的NO及氧自由基，從而阻斷了NO及氧自由基等所介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)，發(fā)揮保護(hù)腎組織的作用。
　　 總之，我們通過(guò)以上三部分研究得到以下結(jié)論：(1)術(shù)中溫度為37℃，雙側(cè)腎臟缺血45分鐘再灌注，24小時(shí)后小鼠尿素氮、肌酐水平明顯升高，達(dá)到急
　　 性腎衰竭，是小鼠缺血再灌注急性腎損傷模型建立的必要條件；(2)AG可降低缺血再灌注急性腎損傷小鼠尿素氮、肌

9、酐水平，保護(hù)腎功能；(3)缺血再灌注急性腎損傷小鼠iNOS mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高，提示缺血再灌注腎損傷可能與iNOS水平升高相關(guān)；(4)AG可以通過(guò)特異性抑制iNOS發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。
　　 缺血再灌注腎損傷是急性腎衰竭的主要原因。損傷后不完全修復(fù)及纖維組織增生可引起持續(xù)性腎臟損壞并逐漸進(jìn)展至慢性腎衰竭，嚴(yán)重危害國(guó)人健康，目前尚不明確其發(fā)病機(jī)制且無(wú)特效治療方法。本研究發(fā)現(xiàn)缺血再灌注腎損傷可引起iNOS明顯升高，加重腎損