乙型肝炎病毒L60V、I97L變異核殼蛋白對(duì)HepG2細(xì)胞HLA-A表達(dá)和細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、背景:HBV感染后的肝病表現(xiàn)有很寬的臨床譜，包括無(wú)癥狀攜帶狀態(tài)、急性自限性肝炎、慢性活動(dòng)性肝炎以及暴發(fā)性肝炎等。HBV感染者免疫清除病毒的主要效應(yīng)細(xì)胞為CD<,8><'+>T細(xì)胞(CTL)、Th細(xì)胞和B細(xì)胞，其中CTL介導(dǎo)的細(xì)胞特異性免疫是主要途徑，決定著感染者的臨床結(jié)局。免疫因素并不能完全解釋HBV感染者復(fù)雜的臨床轉(zhuǎn)歸，HBV變異是另一個(gè)影響臨床結(jié)局的重要因素。近年來(lái)，很多HBV變異株被分離和鑒定，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了廣泛而深入的研

2、究。核殼蛋白是宿主細(xì)胞免疫的核心靶位，在病毒清除和病理?yè)p傷過(guò)程中起著重要作用，因此HBV/C區(qū)基因變異和氨基酸的改變格外引人關(guān)注。累計(jì)文獻(xiàn)和資料，核殼蛋白常見(jiàn)的變異包括P5T、V13A、S35A、L59V、P68L、P130T 和 P135Q等，這些位點(diǎn)變異對(duì)肝細(xì)胞損傷無(wú)明顯影響作用，主要見(jiàn)于無(wú)癥狀攜帶者，可能是不同地理環(huán)境病毒自然進(jìn)化的結(jié)果；核殼蛋白L60V(AA60的亮氨酸被纈氨酸替代)和197L(AA97的異亮氨酸被亮氨酸替代)變

3、異常見(jiàn)于活動(dòng)性乙型肝炎，L60V、197L變異是否加重肝損傷及其作用機(jī)制尚不清楚。通過(guò)構(gòu)建L60V、I97L變異HBV全基因表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，結(jié)果表明L60V、I97L變異HBV株與野毒株HBV對(duì)細(xì)胞HLA-I表達(dá)有不同影響作用；L60V、I97L變異HBV全基因重組腺病毒載體注射到小鼠體內(nèi)的研究表明，L60V、I97L變異病毒株更容易免疫逃避。目前關(guān)于核殼蛋白功能研究尚少見(jiàn)。野毒株、L60V、197L變異核殼蛋白對(duì)細(xì)胞HL

4、A-I表達(dá)的影響作用尚不清楚。HBV全基因組對(duì)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有抵抗作用，但野毒株、L60V、I97L變異核殼蛋白對(duì)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是否存在影響尚不清楚。 目的:研究野毒株核殼蛋白、L60V、I97L 變異核殼蛋白對(duì)HepG2細(xì)胞HLA-A 表達(dá)的影響；研究野毒株核殼蛋白、L60V、I97L變異核殼蛋白對(duì)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的影響，通過(guò)細(xì)胞水平的研究以探討C區(qū)熱點(diǎn)變異核殼蛋白與野毒株可能存在的功能差異。 方法: [

5、1]野毒株C區(qū)基因的獲得：以P3.8II為模板，PCR反應(yīng)擴(kuò)增野毒株核殼蛋白基因全長(zhǎng)，兩端帶有EcoR Ⅰ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠試劑盒回收純化產(chǎn)物。將純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5 α克隆擴(kuò)增，篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒。pMD18-HBV/C 區(qū)基因酶切鑒定。 [2]野毒株核殼蛋白表達(dá)載體pEGFP-WT的構(gòu)建：將pEGFP-C1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化擴(kuò)增，EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，瓊脂糖

6、電泳后回收大片段；質(zhì)粒pMD18-HBV/C 區(qū)基因 EcoRⅠ和 BamHⅠ雙酶切，瓊脂糖電泳后回收小片段。將酶切后的pEGFP-C1質(zhì)粒與HBV/C區(qū)基因進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5 α克隆擴(kuò)增，篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，獲得野毒株表達(dá)載體pEGFP-WT，酶切和測(cè)序鑒定。 [3]pEGFP-L97 和 pEGFP-V60重組載體的獲得：通過(guò)Quick Change試劑盒在pEGFP-WT的基礎(chǔ)上采用特異性引物進(jìn)行定點(diǎn)突變，P

7、CR反應(yīng)產(chǎn)物DpnⅠ酶切，轉(zhuǎn)化XL2-Blue 超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞，鋪板挑取突變克隆，篩出新合成的含突變子鏈的重組載體，酶切測(cè)序鑒定。 [4]重組載體的轉(zhuǎn)染：用 Lipofectamine 2000<'TM>將 pEGFP-C1、pEGFP-WT、pEGFP-V60和pEGFP-L97轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，6小時(shí)后更換為無(wú)抗生素的含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，24小時(shí)后用含G418的培養(yǎng)液篩選。待形成陽(yáng)性單細(xì)胞克隆群落后，用尖吸管

8、吸取單克隆陽(yáng)性細(xì)胞培養(yǎng)，篩選獲得陽(yáng)性細(xì)胞培養(yǎng)連續(xù)傳代3次，建立穩(wěn)定的細(xì)胞株。 [5]EGFP-核殼蛋白融合蛋白的鑒定：轉(zhuǎn)染后用熒光顯微鏡觀察有無(wú)熒光，以觀察轉(zhuǎn)染是否成功。Western blot鑒定核殼蛋白的表達(dá)，UVI凝膠成像系統(tǒng)分析條帶灰度值，用核殼蛋白/β-actin代表核殼蛋白的相對(duì)表達(dá)量。 [6]HLA-A mRNA 和蛋白表達(dá)的檢測(cè)：常規(guī)方法提取細(xì)胞總RNA，按照RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR

9、擴(kuò)增。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠分析系統(tǒng)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HLA-A 蛋白的表達(dá)。將固定好的細(xì)胞每管加入一抗并處理標(biāo)本，通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品管檢測(cè)5000個(gè)細(xì)胞。 [7]細(xì)胞株凋亡的誘導(dǎo)和檢測(cè)：經(jīng)Act-D及 TNF-α誘導(dǎo)刺激各組HepG2 細(xì)胞凋亡，刺激時(shí)間16h、32h、48h，使用流式細(xì)胞術(shù)，利用碘化丙啶染色，檢測(cè)具有亞Gl期DNA含量的細(xì)胞比例，代表凋亡細(xì)胞數(shù)；使用激光共聚焦顯微鏡，利用

10、Hoechst染色觀察32h時(shí)各組凋亡細(xì)胞核的變化。 [8]細(xì)胞株凋亡相關(guān)通路信號(hào)蛋白表達(dá)檢測(cè)：空質(zhì)粒、pEGFP-WT、pEGFP-V60、pEGFP-L97表達(dá)HepG2細(xì)胞株培養(yǎng)48h時(shí)，提取總蛋白，Western blot 檢測(cè) IKK-α、Iκ B-β、NF-κB P65、CaspaSe-8 和caspase～3蛋白在各組中的表達(dá)。 結(jié)果: [1]PCR成功擴(kuò)增野毒株核殼蛋白基因；成功將PCR產(chǎn)物連接到

11、pMD18載體；將雙酶切后的HBV/C區(qū)基因切下并連接到pEGFP-C1上，成功構(gòu)建野毒株核殼蛋白表達(dá)載體pEGFP-WT，酶切和測(cè)序鑒定符合實(shí)驗(yàn)所需；利用特異性引物成功地在pEGFP-WT基礎(chǔ)上實(shí)行了定點(diǎn)突變，獲得帶EGFP與野毒株、L60V、197L變異核殼蛋白的融合蛋白表達(dá)重組載體pEGFP-V60和pEGFP-L97，并經(jīng)測(cè)序證實(shí)。 [2]pEGFP-V60、pEGFP-L97、pEGFP-WT載體和空質(zhì)粒pEGFP-C

12、1表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建、篩選和鑒定：HepG2細(xì)胞的G418最低有效全致死劑量為200μg/mL，確定篩選用濃度為400μg/mL，維持濃度為300μg/mL。通過(guò)Lipofectamine轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒、pEGFP-V60、pEGFP-L97和pEGFP-WT進(jìn)入HepG2細(xì)胞，G418篩選2周，挑取陽(yáng)性細(xì)胞單克隆株。熒光顯微鏡顯示EGFP在各細(xì)胞系強(qiáng)表達(dá)；Western blot檢測(cè)各細(xì)胞系核殼蛋白表達(dá)量無(wú)明顯差別(p>0.05)。

13、 [3]pEGFP-V60、pEGFP-L97、pEGFP-WT和空質(zhì)粒pEGFP-Cl組HepG2細(xì)胞株HLA-A mRNA和蛋白表達(dá)結(jié)果：RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，空質(zhì)粒表達(dá)HepG2細(xì)胞株沒(méi)有檢測(cè)到HLA-A mRNA表達(dá)，pEGFP-L97組細(xì)胞株HLA-A mRNA表達(dá)明顯高于pEGFP-WT組細(xì)胞株，而pEGFP-V60組細(xì)胞株HLA-A mRNA表達(dá)明顯低于pEGFP-WT組細(xì)胞株(p<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表明，pE

14、GFP-V60組細(xì)胞株HLA-A表達(dá)水平明顯低于pEGFP-WT組細(xì)胞株，而pEGFP-L97組細(xì)胞株HLA-A表達(dá)明顯高于pEGFP-WT組細(xì)胞株(p<0.05)。 [4]流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)pEGFP-V60、pEGFP-L97、pEGFP-WT載體和空質(zhì)粒pEGFP-C1組HepG2細(xì)胞株凋亡結(jié)果：在16h，32h，48h時(shí)，pEGFP-V60、pEGFP-L97和pEGFP-WT組細(xì)胞株凋亡率均明顯低于空白質(zhì)粒組細(xì)胞株(p均<

15、0.05)；16h時(shí)pEGFP-L97組細(xì)胞株凋亡比例明顯高于pEGFP-WT組細(xì)胞株(p<0.05)，32h時(shí)pEGFP-V60組細(xì)胞株凋亡比例明顯高于pEGFP-WT組細(xì)胞株(p<0.05)。48h時(shí)，pEGFP-V60、pEGFP-L97組細(xì)胞株的凋亡率均明顯高于pEGFP-WT組細(xì)胞株(p均<0.05)。未加刺激因素的各組細(xì)胞株在0h時(shí)和48h時(shí)的凋亡率均無(wú)明顯變化。 [5]激光共聚焦檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果：32h時(shí)pEGFP

16、-V60、pEGFP-L97組細(xì)胞株凋亡比例均明顯高于pEGFP-WT組細(xì)胞株(p均<0.05)，但低于空白質(zhì)粒組細(xì)胞株(p<0.05)，與流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果相一致。 [6]pEGFP-V60、pEGFP-L97、pEGFP-WT載體和空質(zhì)粒pEGFP-C1組HepG2細(xì)胞株凋亡相關(guān)信號(hào)通路蛋白檢測(cè)：各組細(xì)胞株NF-κB、工KK-α、Iκ B-α蛋白表達(dá)沒(méi)有明顯差別；但pEGFP-WT組細(xì)胞株caspase-3，8表達(dá)低于pEGF

17、P-V60、pEGFP-L97組細(xì)胞株；且三組細(xì)胞株caspase-3，8表達(dá)均低于空白質(zhì)粒組細(xì)胞株。 結(jié)論: [1]我們成功地克隆了EGFF與野毒株核殼蛋白以及L60V、I97L變異核殼蛋白融合表達(dá)載體；野毒株核殼蛋白以及L60V、I97L變異核殼蛋白細(xì)胞株HBcAg表達(dá)量無(wú)明顯差異，能夠進(jìn)一步進(jìn)行各種核殼蛋白功能差異的研究。 [2]核殼蛋白能夠刺激HepG2細(xì)胞HLA-A mRNA和蛋白的表達(dá)；與野毒株核殼蛋