腦出血血腫周?chē)M織炎性因子表達(dá)和奧美沙坦對(duì)免疫反應(yīng)影響的研究.pdf

1、論文Ⅰ亞低溫對(duì)高血壓性腦出血微創(chuàng)血腫清除術(shù)后血腫周?chē)M織炎性因子表達(dá)的研究
　　研究背景:腦出血是常見(jiàn)病、多發(fā)病，死亡率和致殘率極高，腦出血占腦血管病的10％到15％，其死亡率大于50％[1]。而腦出血后的治療方法直接影響療效。對(duì)高血壓性腦出血患者早期使用微創(chuàng)血腫清除術(shù)治療，可以使血腫對(duì)周?chē)X組織的壓迫減輕，由于局部血腫壓迫造成的缺血、水腫也可以得到緩解，血腫清除后，血腫分解產(chǎn)物造成的的血腫周?chē)X組織損傷也可以減輕，從而改善腦功能

2、。而亞低溫治療具有確切的腦保護(hù)作用[2，3]。亞低溫治療的腦保護(hù)作用受到了極大重視，其可以通過(guò)抑制炎性反應(yīng)、減輕腦水腫降低腦組織代謝等保護(hù)腦組織。近年來(lái)，人們對(duì)腦出血后的研究逐漸聚集在了血腫周?chē)X組織的腦功能保護(hù)上，普遍認(rèn)為炎性反應(yīng)參與了腦出血后血腫周?chē)X組織損傷的病理過(guò)程。在腦出血早期，血腫周?chē)植磕X組織中就已經(jīng)存在炎性反應(yīng);其中核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)和炎性細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)起著重要作用，它們可以加重腦出血

3、后血腫周?chē)X組織的損傷。
　　研究目的:采用亞低溫聯(lián)合微創(chuàng)血腫清除術(shù)治療高血壓性腦出血減輕血腫周?chē)X組織的炎性反應(yīng)，使腦功能得以改善，并且此方法安全、有效、可行。
　　研究方法:收集臨床76例急性自發(fā)性高血壓性腦出血患者，隨機(jī)分為微創(chuàng)血腫清除術(shù)組和亞低溫治療聯(lián)合微創(chuàng)血腫清除術(shù)組，治療前后均行NIHSS評(píng)分，微創(chuàng)血腫清除術(shù)組使用顱內(nèi)血腫粉碎穿刺針進(jìn)行微創(chuàng)顱內(nèi)血腫清除術(shù)治療，亞低溫治療聯(lián)合微創(chuàng)血腫清除術(shù)組給予全身水循環(huán)式降溫毯+

4、冰帽腦局部亞低溫治療，所有患者于術(shù)中和術(shù)后1d、3d、7d取沖洗時(shí)所帶出的血腫周?chē)X組織碎塊，經(jīng)甲醛固定保存，標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋后作切片。血腫周?chē)X組織切片的NF-κB表達(dá)采用蘇木素-伊紅(HE)染色和免疫組織化學(xué)法測(cè)定;TNF-α的檢測(cè):于術(shù)后1d、3d、7d清晨抽取空腹靜脈血2-3ml分裝于不同的試管中，采用ELISA法測(cè)定含量。研究結(jié)果:兩組患者神經(jīng)功能缺損程度NIHSS評(píng)分，在第3天和第7天亞低溫治療聯(lián)合微創(chuàng)血腫清除術(shù)組神經(jīng)功能缺損

5、程度低于微創(chuàng)血腫清除術(shù)組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05）。亞低溫治療聯(lián)合微創(chuàng)血腫清除術(shù)組患者神經(jīng)功能缺損程度NIHSS評(píng)分更好。腦出血后血液中TNF-α濃度、血腫周?chē)X組織NF-κB表達(dá)隨病情變化而變化，血清中TNF-α的含量、血腫周?chē)X組織中NF-κB表達(dá)第3天時(shí)達(dá)到高峰。亞低溫治療聯(lián)合微創(chuàng)血腫清除術(shù)組在各時(shí)間點(diǎn)TNF-α含量、NF-κB表達(dá)均低于單純微創(chuàng)血腫清除術(shù)組(p＜0.05）。結(jié)論:亞低溫治療聯(lián)合微創(chuàng)血腫清除術(shù)可以減輕

6、血腫對(duì)周?chē)X組織的損傷，能更好的減輕炎癥反應(yīng)，減輕腦組織損害，改善腦功能。意義:亞低溫治療聯(lián)合微創(chuàng)血腫清除術(shù)這種方法安全、有效、可行，能夠在腦出血急性期減輕腦損傷，改善腦功能，讓更多的腦出血患者獲益。
　　論文Ⅱ奧美沙坦修飾的樹(shù)突細(xì)胞對(duì)T淋巴細(xì)胞免疫功能影響的體外研究
　　研究背景:腦血管病是人類(lèi)死亡和殘疾的主要原因之一。高血壓是腦血管病的主要病因，高血壓也是動(dòng)脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)最常見(jiàn)的危險(xiǎn)因素。因此，積極降壓、抗炎性反應(yīng)治

7、療被用于防治心腦血管病。高血壓動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性免疫炎癥性疾病，它涉及到免疫系統(tǒng)、血管細(xì)胞和多個(gè)器官。免疫細(xì)胞啟動(dòng)和維持局部炎癥。局部免疫炎癥反應(yīng)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展是必不可少的。樹(shù)突細(xì)胞(DCs)和T細(xì)胞有助于局部免疫炎癥應(yīng)答和動(dòng)脈中疾病進(jìn)展。DCs是專(zhuān)職抗原遞呈細(xì)胞(APCs)，遞呈各種外源性和內(nèi)源性抗原給T淋巴細(xì)胞，是先天性免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)之間的一個(gè)重要鏈接。DCs可以將動(dòng)脈粥樣硬化炎性反應(yīng)相關(guān)的抗原遞呈給T淋巴細(xì)胞

8、。DCs表面的共刺激分子CD80、CD86（這是眾所周知的參與免疫突觸形成和活化T細(xì)胞的分子）和MHC-Ⅱ與TLR(Toll-likereceptors,Toll樣受體)和NLR(NOD-like receptor and NACHT-LRR receptor, NOD樣受體和NACHT-亮氨酸重復(fù)序列受體)家族受體準(zhǔn)確地結(jié)合，對(duì)DCs區(qū)分自我和外來(lái)抗原并遞呈給T細(xì)胞的能力是至關(guān)重要的。DCs與T淋巴細(xì)胞結(jié)合后，DCs-T細(xì)胞相互作用，

9、能夠分泌趨化因子和細(xì)胞因子以維持局部炎癥反應(yīng)。
　　DCs與受體結(jié)合后，T輔助細(xì)胞前體細(xì)胞(Th0)被活化，Th0活化后可以分化為T(mén)h1和Th2細(xì)胞。Th1型細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子主要包括干擾素-γ（IFN-γ），IFN-γ介導(dǎo)細(xì)胞免疫炎癥應(yīng)答，誘導(dǎo)并促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化，抑制Th2細(xì)胞免疫反應(yīng);細(xì)胞因子白介素-4(IL-4)和白介素-10(IL-10)主要由Th2型細(xì)胞分泌，其中IL-4可以誘導(dǎo)并促進(jìn)Th2型細(xì)胞的分化，而IL-10

10、可以抑制Th1型細(xì)胞分化。一般Th1的功能亢進(jìn)以及Th1分泌的細(xì)胞因子被認(rèn)為是促炎因素，而Th2及其所分泌的細(xì)胞因子被認(rèn)為是抗炎因素。Th1細(xì)胞能有效地介導(dǎo)細(xì)胞免疫、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞活化以及遲發(fā)性超敏反應(yīng)。Th2細(xì)胞可以介導(dǎo)體液免疫。CD4+T淋巴細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)病變中的主要因素，它依據(jù)局部環(huán)境不同被分化為T(mén)h1和Th2細(xì)胞，在損傷處激活的Th1可能促進(jìn)了粥樣斑塊的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致了動(dòng)脈粥樣斑塊的不穩(wěn)定性。而研究表明

11、Th2細(xì)胞有助于動(dòng)脈粥樣損傷的穩(wěn)定，主要是因?yàn)闄z測(cè)發(fā)現(xiàn)IL-10可以減少I(mǎi)FN-γ的分泌。高血壓除影響患者血流動(dòng)力學(xué)外，其血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)水平也升高、Th1淋巴細(xì)胞功能亢進(jìn)并且Th1/Th2比例失衡。AngⅡ水平升高時(shí)IFN-γ水平也高，并且AngⅡ可以直接引起IFN-γ的分泌，使其水平增高。因此，高血壓被認(rèn)為也可以通過(guò)T淋巴細(xì)胞途徑促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)。而AngⅡ受體拮抗劑(ARBs)-奧美沙坦既可以降低血壓，又可以抑制T

12、淋巴細(xì)胞亢進(jìn)所致的炎癥反應(yīng)。
　　腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）促進(jìn)高血壓和動(dòng)脈粥樣硬化的血管損傷，血管損傷是潛在的高血壓病及其各臟器并發(fā)癥的主要危險(xiǎn)原因。局部RAS在炎癥反應(yīng)中也可能發(fā)揮作用。AngⅡ是RAS的下游活性肽，循環(huán)中AngⅡ通過(guò)與AngⅡ1型(AT1)和2型(AT2)受體結(jié)合后激活信號(hào)傳導(dǎo)通路起作用。AngⅡ在靶組織可以通過(guò)與其AT1和AT2受體的結(jié)合調(diào)節(jié)血管功能。AT1受體廣泛表達(dá)于參與動(dòng)脈粥樣硬化不同類(lèi)型的細(xì)胞。

13、AT1受體介導(dǎo)了大部分AngⅡ的病理生理效應(yīng)，包括血管收縮、促進(jìn)炎癥和纖維化，通過(guò)變化多樣的信號(hào)傳導(dǎo)通路起調(diào)節(jié)介導(dǎo)作用，包括PLC/PKC/Ca2+濃度變化、PLA2、PLD、MAP激酶、酪氨酸激酶、原癌基因的表達(dá)、RhoA/Rho激酶和氧化應(yīng)激。通過(guò)增加氮氧化物源性活性氧的產(chǎn)生和氧化還原反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子激活，AngⅡ促進(jìn)細(xì)胞粘附分子的表達(dá)、誘導(dǎo)合成炎癥介質(zhì)和生長(zhǎng)因子。這些分子使血管通透性增加、白細(xì)胞聚集、鈣化和血管纖維變性，導(dǎo)致血管損傷。

14、而AT2可能會(huì)抵消很多AT1介導(dǎo)的效應(yīng)。
　　AngⅡ喚起炎癥反應(yīng)，并且在由AT1受體介導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化炎性反應(yīng)中起核心作用。ARBs類(lèi)藥物阻斷了AngⅡ絕大多數(shù)不同生物效應(yīng)。奧美沙坦主要與AT1受體結(jié)合，可以阻斷AT1受體介導(dǎo)的AngⅡ生物作用。盡管所有ARBs類(lèi)有共同的或者類(lèi)似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，但是所有ARBs類(lèi)的降壓效果是不同的。臨床使用的每一種ARBs具有獨(dú)特的分子特異性效應(yīng)對(duì)斑塊的消退和穩(wěn)定是非常重要的。奧美沙坦是一種重要的降

15、壓藥物，因其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)而可以減少動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的體積，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。特別是奧美沙坦還具有抗炎作用。同時(shí)，奧美沙坦可以抑制AngⅡ與AT1受體結(jié)合，使AngⅡ濃度升高，而利于與AT2結(jié)合。我們這次研究的重點(diǎn)就是ARBs類(lèi)藥物-奧美沙坦修飾的DCs對(duì)T細(xì)胞的影響，探討其抑制T細(xì)胞的增殖及炎癥反應(yīng)的可能機(jī)制。
　　研究目的:探討奧美沙坦修飾的大鼠DCs對(duì)T淋巴細(xì)胞免疫功能的影響及其相關(guān)機(jī)制。
　　研究方法:

16、　　1.耐受性樹(shù)突細(xì)胞的制備及鑒定
　　無(wú)菌條件下取Lewis大鼠股骨和脛骨，充分沖洗骨髓腔并研磨骨髓后，制備單細(xì)胞懸液。破紅細(xì)胞膜后，將細(xì)胞液置于培養(yǎng)瓶中，加入完全培養(yǎng)液，于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)3天。換液后留取貼壁細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。第7天再換液，換液后18小時(shí)向培養(yǎng)瓶中加入提前配制的奧美沙坦(使其終濃度為10μM)，把相同體積預(yù)先配制的DMSO溶液加入對(duì)照組培養(yǎng)瓶中。繼續(xù)培養(yǎng)，第10天，收集懸浮的細(xì)胞，分別記

17、為奧美沙坦修飾的DCs和未經(jīng)奧美沙坦修飾的DCs。
　　2.DCs表面CD80、CD86和MHC-Ⅱ表面分子的檢測(cè)
　　取每流式測(cè)定管中DCs細(xì)胞數(shù)1×106個(gè)/ml，加入1 ml PBS液洗滌細(xì)胞，離心，2000rpm，5 min，棄上清，加入1.5 ml0.5％ BSA洗滌后，加入1μl抗體，4℃冰箱中孵育30 min，用1.5 ml0.5％ BSA洗兩次，加500μl PBS，混勻，重懸細(xì)胞，用濾網(wǎng)過(guò)濾后，流式細(xì)胞儀進(jìn)

18、行檢測(cè)。
　　3.DCs中IL-10和TGF-β細(xì)胞因子的檢測(cè)
　　每個(gè)流式測(cè)定管中加入DCs細(xì)胞數(shù)1×106個(gè)/ml，加入2 ml PBS洗滌細(xì)胞，2000rpm，離心5 min，離心。加入2％多聚甲醛，放置在4℃，孵育20 min。離心，2000 rpm，5 min。加入2 ml0.5％ BSA洗滌細(xì)胞，再離心，彈起細(xì)胞。加入1 ml皂甙破細(xì)胞膜，室溫放置20 min。用1 ml0.5％ BSA洗滌細(xì)胞2遍，充分震蕩，離

19、心后棄上清液，將細(xì)胞充分彈起。加入PE標(biāo)記小鼠抗大鼠IL-10和兔抗大鼠TGF-β抗體，混勻，在室溫下，避光孵育30 min。再加入2 ml0.5％ BSA洗滌細(xì)胞1次，離心后棄上清液，再將沉淀充分彈起。每管中加入500μl PBS重懸細(xì)胞。用濾網(wǎng)過(guò)濾，立即上機(jī)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)DCs胞內(nèi)細(xì)胞因子IL-10和TGF-β濃度。
　　4.免疫大鼠模型的建立
　　此次實(shí)驗(yàn)中，使用雌性、健康的Lewis大鼠，先將OVA溶于生理鹽水、不

20、完全弗氏佐劑和H37Ra株熱滅活結(jié)核桿菌中，配制成溶膠，然后分別取200μl，皮下注射于每只大鼠的雙后足墊，免疫Lewis大鼠。我們把注射當(dāng)天定做是0天，第8天同等劑量于大鼠背部再次注射一次，劑量與第1次相同，采用雙盲觀察，每日稱重并觀察大鼠的表現(xiàn)，直至第二次免疫后第5天。建立了免疫大鼠模型。
　　5.取淋巴結(jié)制備單細(xì)胞懸液
　　麻醉OVA免疫后大鼠，在無(wú)菌條件下取大鼠雙側(cè)腹股溝淋巴結(jié)，用無(wú)菌研磨棒進(jìn)行研磨，直至組織變白，完

21、全吸取研磨液放入離心管中，制備成淋巴結(jié)單細(xì)胞懸液。離心，棄上清液后，混勻細(xì)胞。用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/ml，備用。
　　6.CD4+T細(xì)胞的分選
　　尼龍棉柱濾過(guò)法分選CD4+T細(xì)胞:先稱取150 mg尼龍棉，填入注射器內(nèi)(10毫升)，使其高度為6 cm，高壓滅菌后備用。用含F(xiàn)BS1640培養(yǎng)液洗滌尼龍棉柱各2次，37℃放置1小時(shí)。過(guò)濾細(xì)胞前，先將棉柱內(nèi)的液體放出，取細(xì)胞數(shù)為2×107個(gè)/ml的淋巴結(jié)單細(xì)胞

22、混懸液，緩慢地滴入棉柱內(nèi)，速度為20滴/min，平放尼龍棉柱，用滴管伸入棉柱內(nèi)的界面內(nèi)加入完全培養(yǎng)液封閉，將尼龍棉柱孵育1h。用常溫的完全培養(yǎng)液洗滌尼龍棉柱3次，控制流速，收集最初的流出液，離心，棄上清液后并混勻細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)/ml，備用，此即為分離純化的CD4+T淋巴細(xì)胞。
　　7.T淋巴細(xì)胞CFSE增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)
　　取CD4+T淋巴細(xì)胞10×106個(gè)到離心管內(nèi);離心后重懸，加入CFSE，37℃孵

23、育，冰上放置后離心，用1640液洗滌2遍，用細(xì)胞完全培養(yǎng)液重懸后，種于24孔板中，把未經(jīng)奧美沙坦修飾的DCs和奧美沙坦修飾的DCs分別加入孔中，同時(shí)加入OVA（終濃度為10μM），與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)72 h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)T淋巴細(xì)胞增殖。
　　8.T細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ細(xì)胞因子ELISA檢測(cè)
　　經(jīng)OVA刺激的淋巴結(jié)T淋巴細(xì)胞與DCs聯(lián)合培養(yǎng)，共60 h，然后取細(xì)胞培養(yǎng)上清液留存。依照IFN-γ試劑盒說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行ELI

24、SA操作，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子IFN-γ的表達(dá)水平。
　　9.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用SPSS17.0軟件進(jìn)行，兩組間比較，使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),p＜0.05被認(rèn)為有差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果采用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(standard deviation，SD)表示。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.奧美沙坦沒(méi)有誘導(dǎo)產(chǎn)生耐受性DCs
　　采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩組DCs間表面分子表達(dá)有趨勢(shì)，共刺

25、激分子CD80、CD86和MHC-Ⅱ在奧美沙坦修飾的DCs組比未經(jīng)奧美沙坦修飾的DCs組低表達(dá)，但統(tǒng)計(jì)學(xué)沒(méi)有差異(p＞0.05)。
　　2.奧美沙坦使DCs胞內(nèi)細(xì)胞因子IL-10的水平上調(diào)
　　通過(guò)流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，奧美沙坦修飾DCs組較未經(jīng)奧美沙坦修飾DCs組明顯高表達(dá)IL-10(p=0.07);但是兩組間TGF-β的水平統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)雖有趨勢(shì)卻沒(méi)有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.T淋巴細(xì)胞增殖被奧美沙坦修飾的DCs抑制
　　

26、經(jīng)CFSE檢測(cè)，奧美沙坦修飾DCs組與未經(jīng)奧美沙坦修飾DCs組之間的T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。奧美沙坦修飾DCs組的T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)明顯低于未經(jīng)奧美沙坦修飾DCs組(p＜0.001)。
　　4.T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子IFN-γ的檢測(cè)
　　OVA免疫大鼠淋巴結(jié)源性T淋巴細(xì)胞與DCs共培養(yǎng)，通過(guò)ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ的水平。結(jié)果顯示，奧美沙坦修飾的DCs組較未經(jīng)奧美沙坦修飾的DCs組低表達(dá)I

27、FN-γ。
　　結(jié)論:
　　1.在體外奧美沙坦雖沒(méi)有誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫耐受性DCs，但奧美沙坦修飾DCs后明顯高表達(dá)胞內(nèi)細(xì)胞因子IL-10。
　　2.奧美沙坦修飾的髓源性DCs抑制了T淋巴細(xì)胞增殖，細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IFN-γ的水平降低。
　　意義:
　　我們通過(guò)在體外研究奧美沙坦是否能夠誘導(dǎo)免疫耐受性DCs的產(chǎn)生，結(jié)果發(fā)現(xiàn)奧美沙坦沒(méi)有誘導(dǎo)免疫耐受性DCs的產(chǎn)生，但卻上調(diào)了胞內(nèi)細(xì)胞因子IL-10水平;同時(shí)發(fā)現(xiàn)