miR-31調(diào)控靶基因SATB2改變肺癌細(xì)胞功能的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:篩選出轉(zhuǎn)移性肺癌患者血清中異常表達(dá)的miRNAs，測定其在肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況，并驗(yàn)證其作用靶點(diǎn)。探討miR-31調(diào)控靶基因SATB2改變肺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的作用機(jī)制。
　　方法:
　　第一部分建立基于實(shí)時熒光定量PCR檢測肺癌患者血清miRNAs的方法，用該法檢測61例肺癌患者血清（其中26例有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移）中9種miRNAs（miR-20a、miR-21、miR-25、miR-29a、miR-31、miR-126

2、、miR-129、miR-145、miR-205）的表達(dá)情況。
　　第二部分應(yīng)用生物信息學(xué)預(yù)測軟件TargetScan、mirBase和PicTar對miR-31靶基因進(jìn)行預(yù)測,選定靶基因SATB2的3'UTR區(qū)克隆到PGL3-control熒光素酶報(bào)告基因載體下游,通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測miR-31對靶基因SATB2的3'UTR區(qū)的調(diào)控能力。將miR-31 mimics/inhibitors瞬時轉(zhuǎn)染人肺腺癌細(xì)胞95D（人高轉(zhuǎn)

3、移肺腺癌細(xì)胞），通過Western blot檢測miR-31對SATB2蛋白表達(dá)的影響。
　　第三部分應(yīng)用Real-time PCR對肺支氣管上皮細(xì)胞（HBE）及肺腺癌細(xì)胞株（A549、H1299、95C和95D）內(nèi)的miR-31作定量檢測。通過Western blot檢測人肺癌細(xì)胞系中SATB2的表達(dá)，選擇SATB2蛋白表達(dá)最高的肺腺癌細(xì)胞株（95D）。建立過表達(dá)或抑制miR-31的人肺腺癌95D細(xì)胞系，同時建立抑制SATB2的

4、人肺腺癌95D細(xì)胞系，應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖的變化，利用單層傷口愈合實(shí)驗(yàn)和transwell小室檢測肺腺癌95D細(xì)胞遷移和侵襲能力的改變。
　　結(jié)果:
　　第一部分實(shí)時熒光定量PCR檢測出miR-31結(jié)果提示:在肺癌血清標(biāo)本中當(dāng)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時其表達(dá)水平顯著降低（t=3.320，P=0.002），其表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　第二部分成功構(gòu)建SATB2的3'UTR區(qū)表達(dá)載體PGL3-SATB2。雙熒光素酶報(bào)告基

5、因分析表明miR-31能夠作用于SATB2的3'UTR。通過Western blot，與對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-31 mimics組的SATB2的蛋白表達(dá)降低，而轉(zhuǎn)染miR-31 inhibitors組的SATB2的蛋白表達(dá)升高，進(jìn)一步證實(shí)SATB2是miR-31的靶基因。
　　第三部分以人肺支氣管上皮細(xì)胞HBE作為對照，在四種肺腺癌細(xì)胞株A549、H1299、95C和95D中， miR-31的表達(dá)水平在95D（人高轉(zhuǎn)移肺腺癌細(xì)胞

6、）細(xì)胞系中是最低的（F=6.976,P=0.001），其表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western blot結(jié)果表明SATB2在高轉(zhuǎn)移潛能的人肺腺癌細(xì)胞株95D中表達(dá)最高。miR-31與SATB2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。在人肺腺癌細(xì)胞95D中過表達(dá)miR-31及抑制SATB2后降低細(xì)胞的遷移和侵襲能力，而抑制miR-31的表達(dá)則會增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。但在95D細(xì)胞中改變miR-31的表達(dá)對細(xì)胞增殖作用不大。
　　結(jié)論:初步篩選與轉(zhuǎn)移性肺