胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素在口腔鱗癌中的表達(dá)及意義.pdf

1、研究背景:
　　頭頸部惡性腫瘤約占全身惡性腫瘤的5.6％，其中80％是鱗癌。而口腔鱗癌是頭頸部惡性腫瘤中比較常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。近幾年來(lái)，隨著對(duì)于腫瘤發(fā)病機(jī)制和治療的研究進(jìn)展，口腔鱗癌的生存率有了顯著提高，5年生存率約60％。口腔鱗癌的發(fā)病是一個(gè)多因素多步驟的過(guò)程，包括眾多的致病因素，如放射線、不良牙體刺激等物理因素，酒精、煙草等化學(xué)刺激，微量元素的缺乏等營(yíng)養(yǎng)因素，等等。最近幾年，隨著腫瘤免疫學(xué)的研究進(jìn)展，對(duì)于口腔腫瘤致病的免疫學(xué)

2、研究受到了越來(lái)越多的重視。機(jī)體免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的改變，腫瘤特異性抗原改變都有可能導(dǎo)致機(jī)體對(duì)于腫瘤細(xì)胞免疫監(jiān)視的缺失，造成腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。
　　胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)是一種與IL-7類似的細(xì)胞因子，由Friend1994年從胸腺基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)上清中分離獲得。TSLP在免疫學(xué)領(lǐng)域研究較多，TSLP的主要作用是可以促進(jìn)T細(xì)胞增殖以及B淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)、分

3、化，而且與樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟、活化和遷移的調(diào)控密切相關(guān)，并在胸腺的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用。TSLP可以在多種組織細(xì)胞中表達(dá)，包括部分腸道上皮、受刺激后的胃粘膜、食管黏膜上皮、心臟、肝臟、前列腺細(xì)胞等等。最近的幾年研究發(fā)現(xiàn)，TSLP可以在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，包括乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、肺癌，等等。腫瘤中的TSLP可以促進(jìn)Th2型細(xì)胞的增殖、分化或募集，并與多種腫瘤細(xì)胞的增殖和血管生成密切相關(guān)。
　　關(guān)于TSLP在口腔鱗癌中的

4、表達(dá)的研究罕見(jiàn)報(bào)道。本文擬采用多種實(shí)驗(yàn)方法研究口腔鱗癌組織中的TSLP的表達(dá)，并且探討TSLP在口腔鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)和腫瘤細(xì)胞的增殖、腫瘤微環(huán)境中免疫狀態(tài)的改變的關(guān)系，以期為口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究提供參考。
　　第一部分口腔鱗癌中TSLP的表達(dá)及臨床意義
　　口腔鱗癌是頭頸部惡性腫瘤的的一種常見(jiàn)的腫瘤。胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素是一種與IL-7類似的細(xì)胞因子，可以在多種組織細(xì)胞和免疫細(xì)胞表面有表達(dá)。最近的研究發(fā)現(xiàn)TSLP可以

5、在多種腫瘤細(xì)胞中有表達(dá)，可以通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。但是TSLP在口腔鱗癌中的表達(dá)還未見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，本部分實(shí)驗(yàn)首先研究TSLP在口腔鱗癌中的表達(dá)情況，并探討其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。
　　目的與方法
　　選取30例具有完整臨床病理資料的口腔鱗癌患者的組織學(xué)標(biāo)本和外周血為研究對(duì)象，并選取10例正常的口腔黏膜作為對(duì)照，采用免疫組化的方法和RT-PCR方法，分別從蛋白水平和mRNA水平比較TSLP、TSLP-R在口腔鱗癌

6、和正常組織中的表達(dá)的差異，并用ELISA方法比較口腔鱗癌患者和正常對(duì)照外周血中TSLP濃度的變化，結(jié)合患者的臨床病理資料，分析TSLP在口腔鱗癌中的表達(dá)及與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。
　　結(jié)果
　　通過(guò)免疫組化的染色，我們發(fā)現(xiàn)TSLP和TSLP-R在口腔鱗癌組織及癌旁組織中都呈高表達(dá)，而在正常組織的上皮細(xì)胞中僅僅是弱表達(dá)或者無(wú)表達(dá)，鱗癌組織中TSLP的mRNA的量是正常組織中的1.9185倍，口腔鱗癌組織和正常對(duì)照組織中的TS

7、LP-mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.016516±0.003522和0.008609±0.00045;口腔鱗癌患者外周血中TSLP的平均濃度是26.16±13.37，而正常對(duì)照的外周血濃度是3.35±3.31，患者組的TSLP的濃度顯著高于對(duì)照組（P＜0.001）。口腔鱗癌患者腫瘤細(xì)胞中的TSLP的表達(dá)與患者的臨床分期、病理分級(jí)、年齡、性別都無(wú)顯著相關(guān)性。口腔鱗癌細(xì)胞本身及周圍浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞同時(shí)存在著TSLP-R的高表達(dá)，染色集中在胞漿中

8、和胞膜上。TSLP-R在口腔鱗癌和癌旁組織中的表達(dá)并無(wú)顯著差異，但是都顯著高于正常的對(duì)照組織。
　　結(jié)論
　　口腔鱗癌組織及癌旁組織中存在著較高的TSLP和TSLP-R的表達(dá)，口腔鱗癌患者的組織和外周血中TSLP和TSLP-R的表達(dá)都顯著高于正常對(duì)照，口腔鱗癌組織中TSLP和患者的臨床病理參數(shù)之間并無(wú)顯著相關(guān)性。但是腫瘤細(xì)胞分泌的TSLP可以直接作用于自身及周圍浸潤(rùn)的大量淋巴細(xì)胞。
　　第二部分口腔鱗癌中TSLP和FO

9、XP3的表達(dá)及關(guān)系研究
　　腫瘤微環(huán)境中的免疫調(diào)節(jié)的改變是促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素。前期的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了口腔鱗癌組織中存在著TSLP和TSLP-R的高表達(dá)。TSLP-R不但可以表達(dá)在腫瘤細(xì)胞自身，還可以表達(dá)在腫瘤周圍浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞的表面。TSLP無(wú)論在外周還是在胸腺中，都可以誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的分化成熟，腫瘤的微環(huán)境中存在的CD4+CD25+Treg細(xì)胞本身即是一種重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，它可以抑制機(jī)體對(duì)于腫瘤細(xì)胞的特異性的免疫反應(yīng)，導(dǎo)

10、致腫瘤的免疫逃逸。FOXP3是CD4+CD25+Treg的功能狀態(tài)的特異性的抗原。本實(shí)驗(yàn)就是通過(guò)研究口腔鱗癌組織微環(huán)境中存在的FOXP3+的Treg細(xì)胞，結(jié)合TSLP和TSLP-R的表達(dá)，探討TSLP在口腔鱗癌中的表達(dá)與FOXP3+淋巴細(xì)胞之間可能存在的關(guān)系。
　　目的及方法
　　選取30例具有完整臨床病理資料的口腔鱗癌患者的組織學(xué)標(biāo)本作為研究對(duì)象，首先運(yùn)用免疫組化的單染，研究FOXP3在口腔鱗癌組織中的表達(dá)，結(jié)合TSLP-

11、R在組織中的表達(dá)狀況，運(yùn)用免疫組化雙染TSLP-R和FOXP3，研究口腔鱗癌中表達(dá)的TSLP和FOXP3+的淋巴細(xì)胞之間的關(guān)系，從而探討TSLP在口腔鱗癌組織微環(huán)境中免疫學(xué)調(diào)節(jié)改變的作用。
　　結(jié)果
　　1.口腔鱗癌組織中可見(jiàn)較多的FOXP3陽(yáng)性淋巴細(xì)胞的存在。腫瘤組和癌旁組FOXP3+陽(yáng)性淋巴細(xì)胞比例分別為（23.32±4.30）％VS（18.24±4.80）％，而正常的對(duì)照組中FOXP3+淋巴細(xì)胞則罕見(jiàn)?？谇击[癌組織和癌

12、旁組織中FOXP3陽(yáng)性淋巴細(xì)胞比例都顯著高于口腔正常對(duì)照黏膜組織。癌旁組織中，同樣可見(jiàn)大量的FOXP3陽(yáng)性的淋巴細(xì)胞存在。
　　2.口腔鱗癌細(xì)胞巢周圍浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞中可見(jiàn)較多的TSLP-R陽(yáng)性的淋巴細(xì)胞，呈團(tuán)或散在存在。
　　3.在口腔鱗癌組織的浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞中，存在著一定數(shù)量的的TSLP和FOXP3雙染的淋巴細(xì)胞。在轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中，我們也發(fā)現(xiàn)了部分的雙染細(xì)胞的存在，而在正常淋巴結(jié)中則并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)雙染細(xì)胞的存在。
　　結(jié)

13、論
　　口腔鱗癌組織中不但存在著大量的FOXP3陽(yáng)性的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，而且在這些FOXP3+細(xì)胞的表面還存在著一定數(shù)量的TSLP-R，口腔鱗癌細(xì)胞中分泌的TSLP，通過(guò)作用于表面具有TSLP-R的淋巴細(xì)胞，促進(jìn)FOXP3+Treg細(xì)胞的分化，成熟或聚集，同時(shí)淋巴結(jié)內(nèi)存在的TSLP，通過(guò)作用于TSLP-R表達(dá)陽(yáng)性的淋巴細(xì)胞，也可誘導(dǎo)FOXP3+的Treg淋巴細(xì)胞的分化及募集，而后者保護(hù)轉(zhuǎn)移的口腔鱗癌細(xì)胞免于淋巴細(xì)胞的殺滅作用，促進(jìn)口腔

14、鱗癌的淋巴轉(zhuǎn)移。
　　第三部分TSLP與口腔鱗癌細(xì)胞增殖的關(guān)系研究
　　腫瘤細(xì)胞的失控增殖是腫瘤發(fā)生的重要因素。在第一部分實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)了口腔鱗癌細(xì)胞不但可以分泌大量的TSLP，存在著TSLP的高表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)了TSLP-R在自身胞漿和胞膜中的表達(dá)?？谇击[癌分泌的TSLP可以通過(guò)與其表面表達(dá)的TSLP-R結(jié)合，以自分泌的方式作用于腫瘤細(xì)胞自身。TSLP在最初發(fā)現(xiàn)時(shí)即發(fā)現(xiàn)具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，組織細(xì)胞中分泌的TSLP可以直接

15、或間接的促進(jìn)多種組織或免疫細(xì)胞的增殖。口腔鱗癌中分泌的TSLP通過(guò)與自身的受體結(jié)合對(duì)于口腔鱗癌細(xì)胞的增殖又是否有關(guān)呢？因此本部分實(shí)驗(yàn)的主要目的就是探討口腔鱗癌腫瘤細(xì)胞中分泌的TSLP與自身增殖的關(guān)系。
　　目的與方法
　　選取口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞系作為研究對(duì)象，培養(yǎng)稀薄，待細(xì)胞恢復(fù)活力后，分別在細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入TSLP、TSLP中和抗體，并且設(shè)立陰性對(duì)照，在不同時(shí)間點(diǎn)，運(yùn)用MTT法研究細(xì)胞的增殖狀況并加以比較，分析三

16、組間細(xì)胞增殖的變化，探討TSLP對(duì)于Tca8113細(xì)胞增殖的作用。
　　結(jié)果
　　1.分別加入TSLP、TSLP中和抗體及PBS24小時(shí)后，三組細(xì)胞均出現(xiàn)了不同程度的增殖現(xiàn)象，其中TSLP組的增殖稍高于對(duì)照組和TSLP中和抗體組，但是差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而對(duì)照組和TSLP中和抗體組的增殖無(wú)明顯差異。
　　2.加藥48小時(shí)，TSLP組和對(duì)照組的腫瘤細(xì)胞均出現(xiàn)了較為明顯的增殖，但是TSLP組的增殖更為明顯，而TSLP中和抗體

17、組的增殖緩慢，三組相比較，發(fā)現(xiàn)TSLP組的增殖顯著高于對(duì)照組及中和抗體組，而對(duì)照組和中和抗體組的增殖差別并不明顯。
　　3.加藥后72小時(shí)，對(duì)照組和TSLP組均出現(xiàn)了更為明顯的增殖，三組相比較，TSLP組顯著高于中和抗體組和對(duì)照組，而對(duì)照組的增殖也顯著高于中和抗體組，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論
　　口腔鱗癌細(xì)胞分泌的TLSP可以直接作用于自身腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，TSLP對(duì)于細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用，在口腔鱗癌發(fā)