視黃酸對鞏膜重塑及細胞外基質(zhì)蛋白Fibulin-1表達的影響.pdf

1、在環(huán)境因素(如長時間的近距離用眼)及遺傳因素等眾多因素的共同作用下，近視眼(Myopia)的發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢，最新流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國南方地區(qū)15歲青少年近視患病率已達到78.4％。近視眼患病影響視覺質(zhì)量的同時，也會造成視網(wǎng)膜的病理性損害，如脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜變性，視網(wǎng)膜脫離等，從而導(dǎo)致不可逆性視力損害甚至致盲。近視眼作為全球性的醫(yī)學(xué)及社會問題，一直是眼科研究的熱點。然而由于近視眼的發(fā)病機制尚不清楚，對近視眼的預(yù)防和治療仍無較大突破。<

2、br>　　 研究資料表明，早期發(fā)育時，視覺刺激誘導(dǎo)眼內(nèi)局部生物化學(xué)信號通路，調(diào)控眼球生長及眼鞏膜重塑，從而影響正視化過程，最終影響眼球的屈光狀態(tài)。最新研究表明視黃酸與視覺控制眼球生長有關(guān)，它作為一種信號因子通過在視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜的合成和分泌，對眼球生長過程中鞏膜的重塑起重要的作用。
　　 鞏膜重塑是近視眼發(fā)生和發(fā)展中的重要生物學(xué)改變，它與鞏膜細胞的分化、增殖和細胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix，ECM)的動態(tài)平

3、衡密切相關(guān)。Fibulin-1是重要的ECM支架蛋白，它參與形成ECM的超分子結(jié)構(gòu)，影響組織重塑過程，參與神經(jīng)嵴來源組織(包括鞏膜)的形態(tài)發(fā)育過程。Fibulin-1在鞏膜中的作用尚不清楚，在鞏膜重塑中，它與視黃酸信號因子是否存在關(guān)系?因此，從細胞和分子水平進一步探討視黃酸對鞏膜細胞外基質(zhì)的影響及對fibulin-1的影響，為近視眼發(fā)病機制的研究提供新的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，將對近視眼的防治具有重要意義。
　　 第一部分、外源性視黃酸

4、對豚鼠鞏膜重塑的研究
　　 目的：觀察外源性視黃酸對三色豚鼠眼軸生長和屈光變化的影響；觀察視黃酸對豚鼠鞏膜膠原，細胞外基質(zhì)蛋白aggrecan及fibulin-1的影響，明確外源性視黃酸在實驗性眼軸增長中對鞏膜的作用。
　　 方法：選用100克左右3-4天三色豚鼠20只，隨機分為正常對照組(P.O.)和實驗組(R.A.)。實驗組予24 mg/kg連續(xù)五天每天喂飼花生油配制的視黃酸0.5ml，正常對照組喂飼0.5ml花生油

5、，兩組豚鼠實驗期間自由進食、飲水，第5天分別測量其眼軸長度、屈光度，觀察其變化。用HE染色測量實驗組鞏膜和正常組鞏膜的厚度變化并通過透射電鏡觀察鞏膜成纖維細胞的變化及膠原纖維的改變，通過免疫熒光法檢測aggrecan及fibulin-1在豚鼠實驗組和正常對照組鞏膜中的表達。
　　 結(jié)果：實驗前豚鼠的屈光狀態(tài)和眼軸長度，兩組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。實驗第5天，對照組豚鼠的眼軸長度為7.628±0.009 mm，實驗組豚鼠

6、眼軸長度為7.743±0.005 mm，兩組比較具有顯著性差異(P＜0.01)。對照組的豚鼠眼的屈光度數(shù)為+6.50±1.60D，實驗組的豚鼠眼的屈光度數(shù)+1.73±0.80D。與對照組相比，實驗組的豚鼠眼分別增加了-4.80D的相對近視，屈光度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。分別將對照組和實驗組后極部鞏膜HE染色，結(jié)果顯示實驗組鞏膜比對照組鞏膜變薄。透射電鏡結(jié)果顯示，實驗組鞏膜膠原數(shù)量減少，直徑變小。免疫組化的結(jié)果顯示，和對照組相比

7、，實驗組鞏膜中aggrecan的表達明顯降低，而fibulin-1表達增高。
　　 結(jié)論：視黃酸在豚鼠眼球發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用，外源性視黃酸的給予能穩(wěn)定有效的誘導(dǎo)眼軸增長，形成相對性的近視漂移并直接引起鞏膜重塑。其中鞏膜細胞外基質(zhì)蛋白aggrecan和fibulin-1的改變可能參與了RA誘導(dǎo)的鞏膜重塑并進一步導(dǎo)致鞏膜變薄。
　　 第二部分、視黃酸對人鞏膜成纖維細胞Fibulin-1表達的影響
　　 目的：

8、本研究旨在觀察全反式視黃酸(all-trans retinoic acid，RA)對培養(yǎng)的人鞏膜成纖維細胞(humans fibroblasts，HSFs)的形態(tài)、增殖影響以及檢測RA對HSFs中fibulin-1表達的影響，明確RA與fibulin-1的關(guān)系并進一步探討fibulin-1在鞏膜重塑中的作用。
　　 方法：體外分離并培養(yǎng)HSFs，采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察HSFs中fibulin-1的表達情況。HSF傳代至第三

9、代，以1×105/孔的密度接種于96孔板，通過CCK-8(Cell Counting Kit-8)法分析不同濃度RA(10-9M～10-4M)作用24小時及48小時對細胞增殖的影響。用Real-time PCR和Western Blot的方法測定RA作用下24、48小時后fibulin-1的表達變化。
　　 結(jié)果：激光掃描共聚焦顯微鏡結(jié)果證實fibulin-1在HSFs中弱表達。高濃度的RA(大于或等于10-5M)對細胞有明顯的

10、抑制作用，該效應(yīng)呈劑量依賴性反應(yīng)，其半數(shù)抑制率IC50=5×10-5M。進一步選取RA濃度(10-8M～10-5M)刺激HSFs24h，HSFs中fibulin-1mRNA表達明顯增加(P＜0.01)，有濃度和時間依從性，其最大效應(yīng)濃度為10-7M。Western Blot結(jié)果也證實，用10-7MRA干預(yù)細胞24及48小時，HSFs中fibulin-1蛋白表達上調(diào)(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：體外實驗進一步證實fibulin-