美國(guó)白蛾核型多角體病毒及其感病寄主檢測(cè)方法的研究.pdf

1、從多方面研究了美國(guó)白蛾核型多角體病毒(Hyphantria cunea nucleopolyhedrovirus，HcNPV)。內(nèi)容包括：HcNPV形態(tài)特征、美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)的感染HcNPV的病理過(guò)程、美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)對(duì)病毒的敏感性、病毒對(duì)寄生性天敵昆蟲(chóng)白蛾周氏嚙小蜂的影響、建立了熒光定量PCR和ELISA分析技術(shù)檢測(cè)核型多角體病毒的方法，并對(duì)病毒在幼蟲(chóng)體內(nèi)增殖動(dòng)態(tài)進(jìn)行了定量檢測(cè)。主要研究?jī)?nèi)容和取得的結(jié)果如下： 1、利用電子顯微鏡進(jìn)行觀

2、察，發(fā)現(xiàn)美國(guó)白蛾核型多角體具有多種形態(tài)：有的為三角形、四角形、也有五角型、六角型的，直徑大小為0.8～2μm；為多粒子包埋型，囊膜大小為0.4～0.6μm×0.57～1.11μm；囊膜內(nèi)病毒粒子的數(shù)目一般4-12個(gè)。 2、測(cè)定了美國(guó)白蛾2～5齡幼蟲(chóng)對(duì)HcNPV的敏感性。2齡幼蟲(chóng)對(duì)HcNPV敏感性最高，5齡幼蟲(chóng)對(duì)病毒敏感性最低。幼蟲(chóng)感染病毒后，其半數(shù)致死濃度LC<,50>值隨著幼蟲(chóng)齡期的增加而增大；3齡、4齡和5齡幼蟲(chóng)的LC<,5

3、0>值分別是2齡幼蟲(chóng)的14倍、105倍和3500倍。以每毫克幼蟲(chóng)體重半數(shù)致死中濃度(毫克體重的LC<,50>值)作為衡量幼蟲(chóng)對(duì)病毒敏感程度的指標(biāo)，則2齡幼蟲(chóng)對(duì)病毒的敏感性分別是3齡、4齡和5齡幼蟲(chóng)的3.3倍、4.5倍和59.7倍。在相同齡期內(nèi)，幼蟲(chóng)感染病毒后半數(shù)死亡時(shí)間隨感染劑量的下降而升高。2齡幼蟲(chóng)在感染劑量為5.3×10<'5>PIBs/mL、5.3×10<'4>PIBs/ mL、5.3×10<'3>PIBs/ mL時(shí)，LT<,50

4、>值分別為4.6天、6天、8.8天；5齡幼蟲(chóng)在感染劑量為5.3×10<'8>PIBs/mL、5.3×10<'7>PIBs/mL時(shí)，LT<,50>值分別為12天、14.2天；而在相同劑量下，半數(shù)死亡時(shí)間隨著齡期的增加而增加。在感染劑量為5.3×10<'5>PIBs/ mL時(shí)，2齡、3齡、4齡幼蟲(chóng)的LT<,50>值分別為4.6天、11.1天、14.7天，5齡幼蟲(chóng)在此劑量下，死亡率只有15％。結(jié)論為：美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)對(duì)其HcNPV的敏感性不僅與幼

5、蟲(chóng)體重相關(guān)，而且與齡期相關(guān)。 3、美國(guó)白蛾幼蟲(chóng)在接毒后，不同組織細(xì)胞隨時(shí)間推延而發(fā)生一系列的病理變化。在感染病毒后48h，觀察到中腸細(xì)胞核內(nèi)產(chǎn)生淺色的環(huán)狀帶；在感染后120h，體壁真皮細(xì)胞發(fā)生異常分裂增生，出現(xiàn)雙層細(xì)胞結(jié)構(gòu)；在168h真皮細(xì)胞層出現(xiàn)3～4層細(xì)胞結(jié)構(gòu)，這是HcNPV感染的特有癥狀；感染后216h，體內(nèi)大部分組織解體，成熟的多角體充滿體腔，幼蟲(chóng)瀕于死亡。 4、根據(jù)美國(guó)白蛾核型多角體病毒的多角體蛋白基因Poly

6、hedrin的保守序列，利用引物設(shè)計(jì)軟件Beacon Designer 5.0設(shè)計(jì)了特異性引物。用SYBR Green熒光染料法構(gòu)建了標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-3.450x+36.154，檢測(cè)靈敏度為10<'1>～10<'2>copies/μL。建立了快速檢測(cè)美國(guó)白蛾核型多角體病毒的方法。 5、通過(guò)已建立的熒光定量PCR檢測(cè)HcNPV多角體蛋白基因Polyhedrin的方法，對(duì)感病幼蟲(chóng)的中腸、血淋巴及整個(gè)蟲(chóng)體進(jìn)行了檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)中腸細(xì)胞在感病后

7、12～108h內(nèi)，每毫克腸重的Polyhedrin基因拷貝數(shù)在10<'4>～10<'5>copies 范圍內(nèi)波動(dòng)，在此范圍內(nèi)并沒(méi)有呈現(xiàn)出明顯的增高或降低的趨勢(shì)；血淋巴樣本Polyhedrin拷貝數(shù)在3～108h內(nèi)呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，但范圍保持在10<'4>copies/μL之內(nèi)。幼蟲(chóng)樣本每毫克體重Polyhedrin拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值與感染時(shí)間(h)對(duì)數(shù)值呈直線相關(guān)，回歸方程式為：y=3.901x±1.094．(R=0.966，P<0.01)。

8、 6、建立了間接ELISA檢測(cè)樣品中的美國(guó)白蛾核型多角體的方法，確定兔抗美國(guó)白蛾核型多角體病毒最佳抗血清蛋白的含量為53.65μg/mL，美國(guó)白蛾病毒液抗原最佳濃度為10<'7>PIBs/mL，最佳封閉條件為0.5％BSA+2％蔗糖封閉37℃水浴2h、4℃24h。美國(guó)白蛾病毒抗原的最小檢出量為0.304μg/mL，即1.77x10<'4>PIBs/mL。 7、美國(guó)白蛾核型多角體病毒濃度在3.12×10<'5>～1.0×10<

9、'7>PIBs/mL 范圍內(nèi)其對(duì)數(shù)值與吸光度OD<,490>呈線性關(guān)系；在死亡前兩天幼蟲(chóng)體內(nèi)多角體達(dá)到平臺(tái)期。 8、選取了包括HcNPV在內(nèi)的目前我國(guó)利用藥劑防治美國(guó)白蛾中有代表性的幾種，模擬林間施藥方式，研究了它們對(duì)美國(guó)白蛾的重要寄生性天敵—白蛾周氏嚙小蜂Chouioia cunea Yang成蜂安全性。同時(shí)研究了HcNPV對(duì)白蛾周氏嚙小蜂繁殖的影響。結(jié)果表明：化學(xué)農(nóng)藥對(duì)白蛾周氏嚙小蜂成蜂的壽命有顯著影響；仿生農(nóng)藥和生物殺蟲(chóng)劑