抗老年癡呆藥物971靶向保護(hù)線粒體的功能作用及機(jī)制研究.pdf

1、老年性癡呆(Alzheimer's disease,AD)是發(fā)生在老年期或老年前期的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性漸進(jìn)性退行性疾病。隨著社會人口的老齡化,AD的發(fā)病率和致殘率、死亡率正逐年升高。AD在臨床上以認(rèn)知障礙、記憶損害和人格改變?yōu)橹饕卣?神經(jīng)病理改變以腦細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFT)和細(xì)胞外老年斑(SP)以及大量神經(jīng)元丟失為主要特征。作為SP的主要組成成分,Aβ是由其前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)

2、經(jīng)β-和γ-分泌酶共同剪切形成的。在病理條件下,Aβ形成高聚集態(tài)的淀粉樣蛋白纖絲,從而對神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用,引起神經(jīng)細(xì)胞的死亡,進(jìn)而形成SP。在AD中,Aβ主要以Aβ1-40和Aβ1-42兩種形式存在,在Aβ聚集中Aβ1-42從時程和量程上均表現(xiàn)比Aβ1-40更強的毒性。因此,Aβ作為一個重要的分子靶點,已經(jīng)成為抗老年癡呆藥物研究與開發(fā)的熱點。
　　 隨著對AD研究的深入,研究者發(fā)現(xiàn)線粒體是Aβ?lián)p傷神經(jīng)細(xì)胞,乃至誘導(dǎo)AD發(fā)生發(fā)

3、展的最重要的亞細(xì)胞器官,同時也是Aβ最早發(fā)生寡聚化的主要場所之一。在老年癡呆的發(fā)生發(fā)展的早期即出現(xiàn)線粒體功能障礙即是證明之一。由于線粒體在Aβ神經(jīng)毒性的產(chǎn)生過程中既充當(dāng)了Aβ攻擊靶點,又擔(dān)任了Aβ發(fā)揮神經(jīng)毒性的中介,因此,抑制Aβ誘導(dǎo)的線粒體的功能損傷成為當(dāng)前抗老年癡呆的重要策略。
　　 971是中國海洋大學(xué)研制的一個酸性寡糖類藥物,作為抗老年癡呆一類新藥,目前正在Ⅱ期臨床研究中。前期研究結(jié)果顯示,971以Aβ為作用靶點,通過與

4、Aβ的特異結(jié)合,抑制纖絲形成,促進(jìn)纖絲解聚,從而拮抗Aβ神經(jīng)毒性,進(jìn)而發(fā)揮抗老年癡呆作用。為了深入研究971的作用機(jī)理,我們利用親和層析方法,垂釣了971的結(jié)合蛋白,并利用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行了鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)971的結(jié)合蛋白中有一大部分屬于線粒體蛋白,提示971可能具有靶向線粒體抗AD的作用。因此,本文中采用體外Flag-C99、C99-Flag以及APP/PS1轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型,借助免疫印跡、免疫共沉淀、細(xì)胞免疫熒光染色、酶聯(lián)免疫以及分子生物學(xué)

5、等方法,探討了971對線粒體功能的保護(hù)作用及其作用機(jī)理:
　　 1.971保護(hù)線粒體功能試驗
　　 利用APP/PS1轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型,采用免疫熒光方法,確定971能夠進(jìn)入線粒體的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步利用體外APP/PS1轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型,將971在0,25,50,100 μg/ml濃度下與細(xì)胞共孵育24小時后,分離線粒體,采用Western Blot技術(shù),檢測了線粒體內(nèi)Aβ寡聚體的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),971進(jìn)入線粒體后,可明顯減少A

6、PP/PS1轉(zhuǎn)基因細(xì)胞線粒體內(nèi)Aβ寡聚體的含量,進(jìn)一步驗證了我們前期的試驗結(jié)果;同時,通過檢測線粒體功能指標(biāo)COX水平和細(xì)胞總體ATP水平的變化,觀察了上述971誘導(dǎo)的線粒體內(nèi)Aβ寡聚體減少對線粒體功能的保護(hù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),971處理后能夠明顯升高線粒體COX的水平,同時升高細(xì)胞總體ATP水平。上述結(jié)果表明971對線粒體功能具有明顯的保護(hù)作用。
　　 2.971抑制Aβ生成試驗
　　 (1)971通過影響Aβ前體蛋白AP

7、P的成熟過程,抑制Aβ生成,進(jìn)一步降低線粒體內(nèi)Aβ寡聚化,發(fā)揮線粒體功能保護(hù)作用
　　 通過基因工程細(xì)胞株構(gòu)建方法,構(gòu)建了Flag-C99轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型。利用該模型細(xì)胞,我們評價971對細(xì)胞內(nèi)Aβ清除的影響。將971在100μg/ml濃度下與模型細(xì)胞共孵育24小時,借助免疫印跡(WB),免疫共沉淀(co-IP)和酶聯(lián)免疫(ELISA)等檢測方法,觀察了細(xì)胞內(nèi)Aβ含量的變化。結(jié)果顯示,971在所檢測濃度下,對細(xì)胞水平的Aβ清除過程

8、無明顯影響。在確定971不影響Aβ清除過程的基礎(chǔ)上,來評價了971對Aβ生成的影響。利用APP/PS1雙轉(zhuǎn)CHO細(xì)胞模型,借助免疫印跡(WB),免疫共沉淀(co-IP)和酶聯(lián)免疫(ELISA)等檢測方法,檢測了細(xì)胞內(nèi)Aβ的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),971在0,25,50,100μg/ml濃度下與細(xì)胞共孵育24小時后,細(xì)胞內(nèi)未成熟形式的APP含量升高,成熟形式的APP含量減少,同時Aβ單體及寡聚體含量均減少。上述結(jié)果說明,971在細(xì)胞水平可影響Aβ

9、前體蛋白APP的成熟過程,從而抑制Aβ的生成。這個結(jié)論同樣在APP轉(zhuǎn)基因CHO-K1細(xì)胞模型、APP轉(zhuǎn)基因N2a細(xì)胞模型得到驗證。上述結(jié)果提示,971可能通過影響Aβ前體蛋白APP的成熟過程,抑制Aβ生成,減少線粒體內(nèi)Aβ含量,進(jìn)一步降低線粒體內(nèi)Aβ寡聚化,從而發(fā)揮保護(hù)線粒體功能的作用。
　　 (2)971通過靶向APP跨膜區(qū),改變C99構(gòu)象,專一性抑制Aβ1-42的生成,下調(diào)Aβ42/Aβ40,從而減少線粒體內(nèi)Aβ寡聚化,發(fā)揮

10、線粒體功能保護(hù)作用
　　 通過基因工程細(xì)胞株構(gòu)建方法制備C99-Flag轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型。利用該細(xì)胞模型,借助免疫印跡(WB),免疫共沉淀(co-IP)和酶聯(lián)免疫(ELISA)等檢測方法,觀察了971在100 μg/ml濃度下與細(xì)胞共孵育24小時后,細(xì)胞內(nèi)不同Aβ片段含量的變化,評價971對細(xì)胞內(nèi)不同Aβ片段生成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),971與細(xì)胞孵育一定時間后,細(xì)胞內(nèi)Aβ1-42含量明顯下降,Aβ1-40含量無明顯變化,從而使Aβ42

11、/Aβ40比例降低。上述結(jié)果說明971可以通過減少高毒性片段Aβ42生成,降低Aβ42/Aβ40比例,進(jìn)一步發(fā)揮線粒體功能保護(hù)的作用。為進(jìn)一步揭示971降低Aβ1-42生成的機(jī)制,我們運用分子對接計算機(jī)模擬技術(shù),模擬了971與Aβ的結(jié)合情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)971可能與APP跨膜區(qū)GXXXG區(qū)域結(jié)合。上述計算機(jī)模擬結(jié)果提示我們,971可能通過靶向APP跨膜區(qū),與C99特異結(jié)合,改變C99構(gòu)象,從而減少Aβ1-42生成,下調(diào)Aβ42/Aβ40。<

12、br>　　 本論文綜合利用現(xiàn)代藥理學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù),結(jié)合計算機(jī)模擬技術(shù),發(fā)現(xiàn)971通過影響Aβ前體蛋白APP的成熟過程,抑制Aβ生成,同時,通過靶向APP跨膜區(qū),改變C99構(gòu)象,專一性抑制Aβ1-42的生成,下調(diào)Aβ42/Aβ40,進(jìn)一步減少線粒體內(nèi)Aβ寡聚化,發(fā)揮保護(hù)線粒體功能的作用。本研究首次確定了971靶向結(jié)粒體功能保護(hù)發(fā)揮抗AD的藥效特性,為其作用機(jī)制的系統(tǒng)闡明及進(jìn)一步臨床研究和應(yīng)用開發(fā)奠定了重要的理論基礎(chǔ)。而971通過抑制