可表達(dá)新型甲型HIN1流感病毒血凝素蛋白輔助病毒依賴型腺病毒載體的構(gòu)建及初步鑒定.pdf

1、目的：新型甲型H1N1流感病毒是威脅人類健康的重要新發(fā)傳染病，雖然已有可用于該病毒預(yù)防和治療的疫苗及藥物，但現(xiàn)有的神經(jīng)氨酸酶抑制劑類抗病毒藥物和以傳統(tǒng)方法制備的流感病毒裂解疫苗均存在一定的局限性。近期研究表明，以重組腺病毒制備流感疫苗具有明顯的優(yōu)越性。本研究以全基因合成的方法獲得甲型H1N1流感病毒血凝素(Hemagglutinin，HA)基因，并以輔助病毒依賴型腺病毒(Helper-dependent adenoviral vecto

2、r，HDAd)載體系統(tǒng)為基礎(chǔ)，構(gòu)建可表達(dá)HA的重組HDAd，為進(jìn)一步的體內(nèi)免疫效果和免疫保護(hù)作用研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：根據(jù)GenBank上登錄的甲流H1N1流感病毒美國加利福尼亞毒株(A/California/07/2009(H1N1))基因序列，采用全基因合成的方法合成由1701個(gè)堿基組成的HA編碼基因。經(jīng)核酸序列分析證實(shí)后，將HA基因克隆至HDAd穿梭載體pSC11-CMV，經(jīng)限制性內(nèi)切酶分析后，進(jìn)一步將含有HA基因的表達(dá)

3、盒克隆至HDAd骨架質(zhì)粒pSC15B，構(gòu)建pSC15B/HA重組質(zhì)粒，并以多組限制性內(nèi)切酶進(jìn)行分析鑒定。PmeⅠ消化pSC15B/HA去除原核復(fù)制元件及抗性基因，獲得HDAd/HA DNA分子，經(jīng)磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染293Cre4細(xì)胞，16 h后感染輔助病毒，收獲HDAd/HA載體粗提液，隨后以HDAd/HA粗提液及輔助病毒連續(xù)共感染293Cre4細(xì)胞直至HDAd/HA達(dá)到復(fù)制極限。隨后，以HDAd/HA和輔助病毒感染293Cre4細(xì)胞大

4、量制備HDAd/HA，CsCl密度梯度及等密度梯度兩次超速離心純化，利用透射電子顯微鏡觀察病毒形態(tài)，分子生物學(xué)技術(shù)體外鑒定HDAd/HA表達(dá)情況。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建了可表達(dá)甲流H1N1流感病毒HA蛋白的HDAd/HA載體，通過與輔助病毒共感染293Cre4細(xì)胞及CsCl梯度法超速離心制備了大量純化的HDAd/HA載體，透射電子顯微鏡觀察到腺病毒，體外感染293細(xì)胞，RT-PCR檢測到HA基因有轉(zhuǎn)錄。
　　結(jié)論：應(yīng)用HDAd