麻疹病毒血凝素基因表達(dá)與抗原性鑒定.pdf

1、血凝素(hemagglutinin，HA)是位于麻疹病毒表面的II型跨膜糖蛋白，主要在麻疹病毒融合到宿主細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮作用。血凝素能與宿主細(xì)胞表面的CD46和SLAM兩大受體結(jié)合，并與病毒表面的融合蛋白(fusion，F(xiàn))相互作用，誘導(dǎo)病毒包膜與細(xì)胞膜發(fā)生融合，此外血凝素一般情況下還具有凝集猴紅細(xì)胞的作用，這一作用可能也與CD46受體結(jié)合有關(guān)。目前研究表明血凝素基因發(fā)生了變化導(dǎo)致出現(xiàn)抗原漂移，可能是麻疹疫情間歇的在局部區(qū)域爆發(fā)且發(fā)病率

2、提高的原因之一。
　　 本文選用2005年浙江省流行毒株MVi/Zhejiang.CHN/7.05/4(該毒株已完成了全基因組測(cè)序工作，GenBank登錄號(hào)為DQ211902)，由于HA含有跨膜區(qū)，在原核表達(dá)系統(tǒng)中跨膜區(qū)和信號(hào)肽的存在通常對(duì)重組蛋白表達(dá)不利，首先利用在線軟件分別對(duì)信號(hào)肽和跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示去除了信號(hào)肽和跨膜區(qū)的HA基因長(zhǎng)度為1670bp，編碼559個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量約為62KDa。從該病毒株細(xì)胞培養(yǎng)液中提

3、取總RNA，通過(guò)一步法RT-PCR擴(kuò)增其血凝素基因，克隆入pGEM-Teasy載體，轉(zhuǎn)化入E.col.DH5α，用Bam.I和HindIII雙酶切鑒定重組子是正確的，雙向測(cè)序確證無(wú)突變。進(jìn)一步將HA基因亞克隆至pET28a(+)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，培養(yǎng)后，用終濃度為1mM的IPTG誘導(dǎo)重組菌表達(dá)。超聲波破碎菌體后，利用SDS-PAGE分析HA基因表達(dá)情況，結(jié)果顯示在62kDa處有一特異性條帶與目的蛋白分子量相一致，且重組蛋

4、白主要以包涵體形式存在，利用Wester.blot方法鑒定重組蛋白發(fā)現(xiàn)其抗原性良好。破碎菌體通過(guò)Ni-NTA樹脂親和層析純化獲得了的高純度目的蛋白，采用Bradford方法測(cè)定蛋白的濃度為0.3512mg/ml。純化的目的蛋白用于建立酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)，對(duì)人群血清標(biāo)本進(jìn)行麻疹病毒IgG抗體檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)重組蛋白具有較好的免疫原性。在本研究中我們成功構(gòu)建了麻疹血凝素基因的表達(dá)載體并在大腸桿菌中進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了抗原性良好的重組蛋白，