HBV相關肝病肝移植受體術后外周免疫細胞及骨髓造血干祖細胞HBV存在狀態(tài)檢測及臨床意義分析.pdf

1、肝移植(liver transplantation，LT)是目前治療終末期肝病(end stageliver disease，ESID)的有效手段。在我國，乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)相關肝病已成為肝移植的主要適應癥。但是肝移植術后，即使在使用拉米夫定(Lamivudine，LAM)和乙肝免疫球蛋白的情況下，仍有較高的HBV再感染率和乙肝(hepatitis B，HB)復發(fā)率，嚴重影響了肝移植的中遠期效果。本課

2、題從研究乙肝病毒相關肝病肝移植術后的免疫．造血系統乙肝病毒庫入手，揭示肝移植術后HBV再感染/HB復發(fā)的可能機制。 在第一部分，我們建立了一種靈敏可靠的檢測HBV共價閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)的實時熒光定量聚合酶鏈式反應方法，為后繼的研究打下了基礎。在第二部分，我們利用密度梯度離心和免疫磁珠分離法獲得骨髓造血干祖細胞和外周血單個核細胞(peripheral blo

3、od mononuclear cell，PBMC)、T細胞、B細胞和單核細胞(monocyte，MNC)，分別檢測總：HBV DNA和HBV cccDNA，證實了細胞內仍存在HBV，但未發(fā)現有復制的證據。在第三部分，我們利用特異性的HBV-Alu-PCR方法檢測PBMC和骨髓造血干祖細胞內HBV X基因的整合情況，發(fā)現上述細胞內無HBV X基因的整合，證實HBV相關肝病肝移植受體術后的外周免疫細胞和骨髓造血干祖細胞不是HBV整合的適宜場

4、所。 第一部分：酶輔助Taq man探針法實時熒光定量PCR檢測HBV共價閉合環(huán)狀DNA方法的建立 目的：建立靈敏可靠的實時熒光定量PCR方法，進行HBV cccDNA的檢測。 方法：利用HBV松弛環(huán)狀DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)和cccDNA結構上的差異，參考現有文獻，合成兩對針對HBV cccDNA的引物，在有或者無綠豆核酸酶(Mung Bean Nuclease，MBN)輔

5、助的情況下，利用不同濃度的從Dane顆粒中提取的HBV rcDNA和含HBV adr<,4>亞型全基因組的pBHB4質粒為模板，通過預實驗選擇最佳引物并確定MBN的最適用量，建立用于檢測HBV cccDNA的酶輔助實時熒光定量PCR(real-timefluorescence quantitative PCR，RT-FQ PCR)方法。 結果：1．兩對引物均可擴增cccDNA，也可擴增較高濃度的HBV rcDNA，即對HBV c

6、ccDNA的擴增僅具有相對特異性；2．MBN可特異性降解HBV rcDNA的單鏈部分，提高HBV cccDNA引物的特異性，其最適用量為5．0IU；3．跨越HBV rcDNA雙鏈上兩個缺口的引物對HBVcccDNA的特異性高于僅跨越一個缺口的引物；4．在MBN輔助下，利用跨越HBVmDNA雙鏈兩個缺口的引物，建立了檢測HBV cccDNA的Taq man探針RT-FQ PCR方法，其檢測限為5．00x10<'2>～5.00×10<'8>

7、copies/ml。 結論：用于HBV cccDNA檢測的酶輔助RT-FQ PCR方法成功建立，靈敏度高，特異性好，能滿足研究的需要。 第二部分：HBV相關肝病肝移植受體術后外周免疫細胞與骨髓CD34+細胞總HBV DNA及HBV cccDNA檢測與臨床意義分析 目的：了解HBV相關肝病肝移植受體術后，在持續(xù)規(guī)范拉米夫定聯合乙肝免疫球蛋白抗病毒治療下，外周免疫細胞與骨髓造血干祖細胞內HBV含量及其復制狀態(tài)，分析其

8、臨床意義。 方法：25例肝移植受體(男22，女3)術后均應用拉米夫定聯合小劑量乙肝免疫球蛋白抗病毒治療。單用FK<,506>抗排異者12例，單用CsA抗排異者13例。平均術后時間為33.32±14.81月(11～77月)，平均年齡為45.88±8.71歲(36～64歲)。術前非活躍復制者7例；HBV活躍復制者18例，其血清HBV DNA平均滴度為10<'5.954±1.457>copies/ml(5.23×10<'3>～8.26

9、×10<'7>copies/ml)。采集25例HBV相關肝病肝移植受體的外周靜脈血及其中23例的骨髓血，以密度梯度離心結合單克隆免疫磁珠分離法獲取單個核細胞、單核細胞、T細胞、B細胞和骨髓造血干祖細胞(CD<,34><'+>細胞)，提取細胞內DNA，以實時熒光定量PCR分別檢測各種細胞內總HBVDNA和HBV cccDNA。同時采集血樣檢測血清HBV DNA定量、乙肝表面抗體濃度、乙肝標志物、血藥濃度。 結果：25例Anti-H

10、Bs均為陽性，平均全血表面抗體濃度為119.14±90.7砌幾；所有受體的血清HBV抗原成分均為陰性；Anti-HBe和Anti-HBc都陽性者5例，Anci-HBe和Anti-HBc都陰性者6例；Anti-HBe陽性而Anlti-HBc陰性者1例；Anti-HBe陰性而Anti-HBc陽性者13例。所有受體血清HBV DNA陰性。25例受體的PBMC、MNC(第9和第17例除外)、B(第8例除外)、T、CD<,34><'+>細胞內總H

11、BV DNA均呈陽性，平均濃度分別為10<'3.3263±0..6956>、10<'2.9425±0.6462>、10<'2.7213±0.6223>、10<'2.9522±0.9319<和10<'3.3373±0.6583>copies/10<'6>cells。方差分析表明不同細胞內HBV DAN含量有差異(F=3.302，P=0.013)，多因素分析表明主要的外周免疫細胞T細胞、B細胞和MNC內的：HBV DNA含量與不完全相同的因

12、素相關。所有細胞內及血清內均未檢測到HBV cccDNA。 結論：HBV相關肝病肝移植術后，即使在較長的術后時間以及規(guī)范的抗病毒治療之下，外周免疫細胞及骨髓造血干祖細胞(CD<,34><'+>細胞)內均有H-BV DNA低濃度存在，且受不全相同的因素影響。雖然未檢測到細胞內HBV cccDNA，但外周免疫細胞與骨髓造血干祖細胞內的HBV DNA均持續(xù)陽性，不能排除外周免疫細胞和骨髓造血干祖細胞仍存在極低水平的HBV復制。在此情況

13、下，不主張中止術后的抗病毒治療。免疫細胞內HBV含量與免疫功能的關系也待深入研究。 第三部分：利用HBV-Alu-PCR檢測HBV相關肝病肝移植受體術后外周血單個核細胞與骨髓造血干祖細胞(CD34+)HBVX基因整合狀態(tài) 目的：了解HBV X基因在HBV相關肝病肝移植受體術后外周免疫細胞和骨髓CD<,34><'+>細胞內的整合情況及其對PBMC內HBV長期維持陽性的意義。 方法：病例選擇及其基本臨床資料同第二部分

14、。獲得其PBMC及骨髓CD<,34><'+>細胞后，提取細胞DNA。因x基因的整合頻率最高，設計HBV x基因的特異引物，利用HBV-Alu-PCR方法進行三輪半巢式PCR，終產物進行電泳并回收、連接載體、篩選擴增后測序，檢測有無X基因整合。 結果：經PCR后電泳及測序分析，25例HBv相關肝病肝移植受體術后的PBMC內未檢測出HBV X基因的整合，其中采集到骨髓標本的23例CD<,34><'+>細胞中亦未檢測到HBV X基因的