沙利度胺抑制兔實(shí)驗(yàn)性腹主動(dòng)脈瘤生長(zhǎng)的研究.pdf

1、背景：
　　 腹主動(dòng)脈瘤（abdominalaorticaneurysm，AAA）是腹主動(dòng)脈的永久性、局限性擴(kuò)張性疾病，多見于老年男性，男女發(fā)病率之比為3.5∶1，據(jù)統(tǒng)計(jì)，在65～80歲的男性人群中，AAA的患病率達(dá)4-8％。AAA年新發(fā)病率為0.4-0.67％。在美國(guó)，每年有約150，000名患者因AAA住院，超過30，000人行AAA開腹手術(shù)治療，有約15，000人最終死于AAA破裂。隨著年齡增長(zhǎng)，AAA發(fā)病率呈逐漸增高趨勢(shì)

2、，瘤體年擴(kuò)張率亦加快，一旦發(fā)生破裂，死亡率可達(dá)90％。AAA儼然已成為具有高致死率、嚴(yán)重威脅人類健康的主要疾病之一。
　　 AAA的高致死率主要緣于AAA的破裂。AAA直徑是預(yù)測(cè)其破裂風(fēng)險(xiǎn)和決定治療方式的主要指標(biāo)。一般的，對(duì)于直徑≥5.5cm的AAA，其破裂的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加，動(dòng)脈瘤切除人工血管置換和腔內(nèi)支架隔絕術(shù)是防止AAA破裂的有效途徑。然而，對(duì)于直徑＜5.5cm、瘤體擴(kuò)張緩慢、近期破裂的風(fēng)險(xiǎn)很低的無癥狀小AAA，建議定期隨訪觀

3、察。相關(guān)的臨床研究結(jié)果表明，對(duì)于小AAA，早期手術(shù)干預(yù)和定期隨訪觀察兩組患者的長(zhǎng)期生存率并無明顯差異，即早期手術(shù)并不能明顯改善其長(zhǎng)期生存率，這一結(jié)果也證實(shí)對(duì)于小AAA而言，定期隨訪觀察是相對(duì)安全的，建議可在瘤體直徑擴(kuò)張率≥1cm/年或直徑達(dá)到5.5cm時(shí)再行常規(guī)開腹或腔內(nèi)修復(fù)術(shù)。但是，AAA的擴(kuò)張是不可逆的，其一旦形成必然進(jìn)行性增大，如果等到瘤體增大瀕臨破裂或出現(xiàn)癥狀再手術(shù)則隨著患者年齡增大、全身狀況進(jìn)一步減退，手術(shù)治療風(fēng)險(xiǎn)將數(shù)倍于早期

4、治療。顯然，對(duì)于絕大多數(shù)小AAA患者，這種基于單純“觀察等待”基礎(chǔ)上的策略是不夠的，尋求一種更為積極的、無創(chuàng)的方法抑制甚或逆轉(zhuǎn)動(dòng)脈瘤擴(kuò)張、防止其破裂或降低破裂風(fēng)險(xiǎn)或許更有意義。
　　 AAA是遺傳、環(huán)境、生物化學(xué)等多因素共同作用的結(jié)果，動(dòng)脈粥樣硬化、感染、炎癥性疾病、膠原及彈性蛋白遺傳缺陷、蛋白酶活性增強(qiáng)或抑制作用減弱以及機(jī)械性因素等，都有導(dǎo)致AAA的可能。各種因素導(dǎo)致血管壁受損，免疫反應(yīng)被激活，引起局部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、炎癥遞質(zhì)及

5、各種蛋白水解酶異常表達(dá)與活化，進(jìn)而導(dǎo)致動(dòng)脈中膜彈力蛋白降解、膠原纖維代謝失衡、血管平滑肌細(xì)胞凋亡，最終動(dòng)脈壁失去彈性，不能耐受血流沖擊而進(jìn)行性擴(kuò)張形成動(dòng)脈瘤。局部動(dòng)脈瘤壁慢性炎癥、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解和重構(gòu)、血管平滑肌細(xì)胞凋亡以及新生血管生成是腹主動(dòng)脈瘤的主要病理學(xué)特征，尤其是以巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞為主的透壁性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)與腹主動(dòng)脈瘤的擴(kuò)張成正相關(guān)。其一，浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞可分泌大量的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和其他蛋白水解酶，引起主動(dòng)脈

6、壁彈力蛋白和膠原纖維等結(jié)構(gòu)性蛋白的降解，削弱動(dòng)脈瘤壁、繼發(fā)附壁血栓形成進(jìn)而導(dǎo)致動(dòng)脈瘤進(jìn)展;其二，炎性細(xì)胞在瘤壁中分泌如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、干擾素-γ（IFN-γ）等多種炎性細(xì)胞因子，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥反應(yīng)，加重動(dòng)脈瘤的進(jìn)展。動(dòng)脈中層新生血管形成和血管平滑肌細(xì)胞減少也是腹主動(dòng)脈瘤的重要特征。瘤腔內(nèi)的附壁血栓可引起內(nèi)膜組織細(xì)胞缺氧，進(jìn)而誘發(fā)新生血管形成和炎癥。血栓內(nèi)的炎癥細(xì)

7、胞也可以釋放諸如MMP-9、尿激酶型纖溶酶原激活劑等活性蛋白水解酶。
　　 AAA形成及擴(kuò)張機(jī)制的逐步闡明為應(yīng)用藥物來延緩、阻止甚至逆轉(zhuǎn)動(dòng)脈瘤的病理學(xué)進(jìn)程提供了理論依據(jù)，即理論上通過藥物抑制動(dòng)脈壁炎癥、新生血管生成以及調(diào)節(jié)免疫等方法可以抑制AAA的擴(kuò)張。我們期待藥物干預(yù)能為小AAA的穩(wěn)定提供有效的治療。而相對(duì)于開發(fā)新藥，研究可能抑制AAA進(jìn)程的現(xiàn)行一線臨床藥物的可行性可能更強(qiáng)。目前國(guó)外學(xué)者已經(jīng)開展并證實(shí)對(duì)AAA形成有抑制作用的藥

8、物包括他汀類藥物、四環(huán)素類、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑、免疫抑制劑、非甾體類抗炎藥、核因子κB(NF-κB)抑制劑及c-jun氨基末端激酶(JNK)抑制劑等。
　　 沙利度胺又名酞胺哌啶酮，最初作為鎮(zhèn)靜劑治療妊娠嘔吐，后因發(fā)現(xiàn)有明顯的致畸作用（嬰兒海豹肢）而被禁用。然而，各國(guó)學(xué)者對(duì)沙利度胺的研究從未因此停滯。近年來發(fā)現(xiàn)沙利度胺具有顯著的抗炎、抗血管生成及免疫調(diào)節(jié)等作用而重新被應(yīng)用于臨床，用于麻風(fēng)結(jié)節(jié)性紅斑、系

9、統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性骨髓瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、白塞氏病等的治療并顯示出特有的療效。最近研究表明，沙利度胺對(duì)大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后新生內(nèi)膜的增生及兔動(dòng)脈粥樣硬化形成有明顯抑制，其機(jī)制可能主要與其下調(diào)TNF-α的表達(dá)有關(guān)。
　　 基于炎癥、免疫機(jī)制在AAA形成、擴(kuò)張過程中的重要作用及沙利度胺的抗炎、抗血管生成、免疫調(diào)節(jié)等藥理學(xué)作用，沙利度胺對(duì)AAA生長(zhǎng)是否有抑制作用目前國(guó)內(nèi)外均未見有關(guān)研究。推測(cè)沙利度胺可能通過其抗炎、免疫調(diào)節(jié)及抗血管生

10、成作用在AAA的治療中亦起重要作用。
　　 目的：
　　 建立兔腎下AAA模型，就沙利度胺對(duì)AAA生長(zhǎng)的影響從大體形態(tài)、影像學(xué)、組織病理學(xué)、分子生物學(xué)等方面進(jìn)行全面、動(dòng)態(tài)觀察，研究沙利度胺對(duì)AAA的擴(kuò)張是否有抑制作用，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步闡釋AAA的發(fā)病機(jī)制，為AAA的臨床藥物治療提供參考。
　　 方法：
　　 選取健康雄性新西蘭白兔（體重2.5-3.0kg），采用豬胰Ⅰ型彈力蛋白酶灌注腎下腹主動(dòng)脈建立兔AA

11、A模型，術(shù)后1周對(duì)手術(shù)兔行腹主動(dòng)脈超聲檢查，了解成瘤情況，測(cè)量灌注段最大內(nèi)徑，以灌注段腹主動(dòng)脈擴(kuò)張超過其近端正常腹主動(dòng)脈直徑的50％作為造模成功標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算擴(kuò)張率及造模成功率。為研究沙利度胺對(duì)腹主動(dòng)脈瘤生長(zhǎng)的影響，術(shù)后1周時(shí)超聲檢查確認(rèn)造模成功的兔15只，單盲、隨機(jī)分為三組，即沙利度胺治療組(AAA/Thd，n=5)和模型對(duì)照組(AAA/Con，n=5)，于術(shù)后1周始，每天一次分別給予胃灌注沙利度胺生理鹽水懸液（100mg/kg/day與

12、5ml生理鹽水混勻）和生理鹽水（5ml/只/天），直至術(shù)后4周;其余5只術(shù)后1周時(shí)再次手術(shù)，以采集標(biāo)本作為藥物干預(yù)前的基礎(chǔ)對(duì)照。另取未行手術(shù)造模的兔5只，于常規(guī)飼養(yǎng)1周后采集標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)正常對(duì)照。各組兔于術(shù)前及術(shù)后1周、2周、4周先后行多普勒超聲檢查，評(píng)價(jià)比較腹主動(dòng)脈術(shù)后擴(kuò)張情況，于術(shù)后1周、4周時(shí)同時(shí)行腹主動(dòng)脈造影，進(jìn)一步評(píng)價(jià)AAA擴(kuò)張情況。標(biāo)本采集前于生理壓力下測(cè)量、記錄腹主動(dòng)脈最大外徑。采集的腹主動(dòng)脈標(biāo)本分成兩份，一份分割后立即置

13、于4％多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋用于組織病理學(xué)研究，另一份速凍于-80℃低溫冰箱備用于WesternBlot分析。術(shù)前及術(shù)后1周、4周時(shí)分組自兔耳緣靜脈采集靜脈血2ml，離心（3000轉(zhuǎn)/分鐘×5min，4℃）后取上清液置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用蘇木素-伊紅(HE)染色和彈力纖維EVG染色分別評(píng)價(jià)沙利度胺治療前后動(dòng)脈瘤壁炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、管腔化微血管密度變化及彈力纖維降解情況。采用免疫組化、Westernblot方法對(duì)組織標(biāo)本中TNF

14、-α、MMP-9、VEGF等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)進(jìn)行定性和定量研究，分析比較沙利度胺對(duì)其表達(dá)的影響。采用ELISA法研究沙利度胺對(duì)循環(huán)促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β的影響。所有計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05判定差異的顯著性。
　　 結(jié)果：
　　 1.本課題應(yīng)用腎下腹主動(dòng)脈彈力蛋白酶加壓灌注法成功建立兔AAA實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?8只兔分批建

15、模，術(shù)后1周內(nèi)死亡2只，1只截癱，術(shù)后1周超聲檢查確認(rèn)共有15只造模成功，成瘤率85％。15只成模兔術(shù)前、術(shù)后1周超聲檢測(cè)其腹主動(dòng)脈最大內(nèi)徑分別為2.9±0.3mm和5.0±0.7mm，平均擴(kuò)張率為71％。其中5只成模兔在術(shù)后1周時(shí)處死采集標(biāo)本，剖視動(dòng)脈瘤見其內(nèi)膜失去正常光滑形態(tài)，壁增厚，有的腔內(nèi)有附壁血栓形成。
　　 2.為研究沙利度胺對(duì)AAA生長(zhǎng)的影響，我們對(duì)兔AAA模型進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察和評(píng)價(jià)。彈力蛋白酶灌注前及灌注后1周，沙利

16、度胺治療組和模型對(duì)照組腹主動(dòng)脈最大外徑、內(nèi)徑差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。彈力蛋白酶灌注后4周，模型對(duì)照組瘤體外徑較1周時(shí)明顯增大，而沙利度胺治療組動(dòng)脈瘤的生長(zhǎng)被顯著抑制，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），治療組瘤體擴(kuò)張率平均降低46％(AAA/Tha:5.2±0.4mmvs.AAA/Con:7.6±0.9mm,P＜0.001)。該結(jié)果進(jìn)一步被超聲和血管造影檢查結(jié)果所證實(shí)。血管超聲檢測(cè)結(jié)果顯示，沙利度胺治療1周后，與模型對(duì)照組相比較，AAA擴(kuò)

17、張明顯減緩，治療3周后動(dòng)脈瘤最大內(nèi)徑明顯低于模型對(duì)照組，擴(kuò)張率平均降低49％。血管造影結(jié)果顯示術(shù)后4周時(shí)沙利度胺治療組AAA擴(kuò)張程度明顯低于模型對(duì)照組。
　　 3.為了觀察沙利度胺對(duì)兔AAA瘤壁炎癥反應(yīng)及血管生成的影響，對(duì)各組組織樣本進(jìn)行HE染色，顯微鏡下分別觀察炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及管腔化微血管形成情況。結(jié)果顯示正常對(duì)照組腹主動(dòng)脈壁無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，彈力蛋白酶灌注后1周動(dòng)脈瘤壁可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞主要位于中膜及外膜，以淋

18、巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為主;灌注后4周時(shí)模型對(duì)照組動(dòng)脈瘤壁炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)進(jìn)一步增多，與模型對(duì)照組相比，沙利度胺治療3周后，瘤壁炎癥顯著減輕，組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。彈力蛋白酶灌注后1周瘤壁管腔化微血管密度與正常腹主動(dòng)脈相比未見明顯變化，彈力蛋白酶灌注后4周時(shí)模型對(duì)照組見動(dòng)脈瘤壁外膜管腔化微血管明顯增加，沙利度胺治療組管腔化微血管則明顯低于模型對(duì)照組（P＜0.001）。
　　 4.免疫組化結(jié)果顯示，正常腹主動(dòng)脈TNF-α、

19、MMP-9、VEGF均呈陰性表達(dá)，彈力蛋白酶灌注后1周表達(dá)均明顯增強(qiáng)，陽性表達(dá)部位多以中膜和外膜為主;術(shù)后4周時(shí)模型對(duì)照組陽性表達(dá)的區(qū)域及強(qiáng)度進(jìn)一步增加，動(dòng)脈壁全層均可見大量棕黃色顆粒，與模型對(duì)照組比較，沙利度胺治療組表達(dá)強(qiáng)度均明顯減弱。
　　 5.Westernblot分析進(jìn)一步顯示，術(shù)后4周時(shí)沙利度胺治療組TNF-α、MMP-9、VEGF表達(dá)水平與模型對(duì)照組相比分別平均降低47％、48％、75％。
　　 6.ELIS

20、A法進(jìn)一步檢測(cè)各組兔血清中TNF-α和IL-1β水平。結(jié)果顯示術(shù)后1周血清中TNF-α和IL-1β水平增高，術(shù)后4周時(shí)模型對(duì)照組TNF-α和IL-1β水平進(jìn)一步明顯增高，而沙利度胺組呈現(xiàn)下降或僅輕度升高趨勢(shì)，與模型對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.001)。
　　 結(jié)論：
　　 本課題采用彈力蛋白酶灌注法成功建立了穩(wěn)定的兔AAA實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，首次證實(shí)沙利度胺可通過其抗炎、免疫調(diào)節(jié)及抗血管生成等藥理作用顯著抑制兔實(shí)驗(yàn)性AAA的生