CALCINEURIN-MEF2C信號途徑參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞肥大.pdf

1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)和膜型/分泌型蛋白質(zhì)合成、折疊的重要細(xì)胞器,對維持心肌細(xì)胞鈣和功能蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)具有重要作用。ER對應(yīng)激刺激非常敏感,多種因素如鈣紊亂、蛋白合成增加、缺血、缺氧等因素均可觸發(fā)ER應(yīng)激。適當(dāng)?shù)腅R應(yīng)激誘導(dǎo)ER分子伴侶如葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白、鈣網(wǎng)蛋白等表達(dá)上調(diào),增強(qiáng)ER鈣調(diào)節(jié)和處理未折疊蛋白的能力,具有細(xì)胞保護(hù)作用；但是,持續(xù)或嚴(yán)重的ER應(yīng)激可觸發(fā)ER凋亡信號通路,促進(jìn)ER重要的促凋亡蛋白C表達(dá)增加和capase-12剪切活化

2、,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和組織損傷。蛋白激酶R樣ER激酶是重要的ER跨膜蛋白,ER應(yīng)激時(shí)GRP78與PERK的解離激活PERK,誘導(dǎo)激活型轉(zhuǎn)錄因子4轉(zhuǎn)錄及其下游靶分子CHOP表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
　　 多種證據(jù)表明ER應(yīng)激與神經(jīng)退行性變、糖尿病性心肌病和缺血/再灌注損傷等多種疾病密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)心肌肥大時(shí)ER應(yīng)激分子CRT、GRP78、GRP94等表達(dá)顯著上調(diào),CHOP介導(dǎo)的ER應(yīng)激凋亡通路參與了心力衰竭過程中的細(xì)胞凋亡,提示心肌肥大過

3、程中存在ER應(yīng)激反應(yīng),但ER應(yīng)激在心肌肥大發(fā)生、發(fā)展中的變化及作用目前并不清楚。心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平升高參與了心肌肥大的發(fā)生,是觸發(fā)心肌肥大反應(yīng)的基本信號。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶是一種受細(xì)胞漿Ca2+及鈣調(diào)素調(diào)控的蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶,由催化亞基CnA和調(diào)節(jié)亞基CnB組成,在T細(xì)胞活化、心肌肥大、細(xì)胞周期調(diào)控等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮關(guān)鍵性的調(diào)控作用。心肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2c是MEF2c家族中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)參與心臟發(fā)育的分子,并被CaN激活,但是C

4、aN-MEF2c信號途徑在ER應(yīng)激誘導(dǎo)心肌肥大中的作用目前尚未報(bào)道。
　　 本工作首先在大鼠腹主動(dòng)脈狹窄致高血壓、心肌肥大模型上,探討ER應(yīng)激在心肌肥大發(fā)生、發(fā)展過程中的作用；其次采用ER應(yīng)激誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素和衣霉素作用于原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞,觀察TG和TM對心肌細(xì)胞肥大和ER應(yīng)激的影響,并探討CaN-MEF2c信號途徑在ER應(yīng)激誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大過程中的作用。主要實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果如下:
　　 1 ER應(yīng)激參與大鼠腹主動(dòng)脈狹

5、窄致高血壓心肌肥大發(fā)生、發(fā)展過程
　　 本部分實(shí)驗(yàn)旨在觀察ER應(yīng)激反應(yīng)在腹主動(dòng)脈狹窄致高血壓大鼠心肌肥大發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。健康雄性Wistar大鼠85只,隨機(jī)分為模型組和假手術(shù)組,模型組行腹主動(dòng)脈狹窄術(shù),假手術(shù)組僅分離腹主動(dòng)脈不行狹窄術(shù),分別于術(shù)后1d、3d、7d、14d、28d時(shí)觀察各組血流動(dòng)力學(xué)變化,測定全心重/體重比和左心室重/體重比,雙向電泳-質(zhì)譜分析技術(shù)檢測術(shù)后28d心肌組織蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化,RT-PCR技術(shù)檢

6、測左心室心肌組織ER應(yīng)激分子GRP78、CRT和CHOP等mRNA表達(dá)變化,Western blot分析α-肌動(dòng)蛋白、GRP78、CRT、CHOP,以及凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bc1-2等表達(dá)變化。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)腹主動(dòng)脈狹窄誘導(dǎo)大鼠心肌肥大,與假手術(shù)組比較,術(shù)后7d模型組大鼠血壓升高,心功能代償性增加,HW/BW和LVW/BW顯著增加。狹窄術(shù)后28 d心肌肥大標(biāo)志性蛋白肌球蛋白輕鏈表達(dá)上調(diào),而心臟α-actin前體和α-肌球蛋白重

7、鏈表達(dá)下調(diào),Western blot證實(shí)模型組心肌組織α-actin表達(dá)較假手術(shù)組顯著增加。其次發(fā)現(xiàn)模型組CRT mRNA表達(dá)于術(shù)后1 d即發(fā)生顯著上調(diào),較假手術(shù)組增加136％:GRP78表達(dá)于術(shù)后7 d顯著增加,其高表達(dá)均持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。長期ER應(yīng)激觸發(fā)CHOP凋亡途徑,模型組大鼠心肌組織CHOP和促凋亡蛋白Bax表達(dá)均于術(shù)后14 d顯著增加,而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低。上述結(jié)果提示腹主動(dòng)脈狹窄早期即可觸發(fā)ER應(yīng)激,誘導(dǎo)ER分子伴

8、侶表達(dá)增加,ER應(yīng)激反應(yīng)可能參與了腹主動(dòng)脈狹窄致大鼠高血壓、心肌肥大過程。CHOP介導(dǎo)的ER應(yīng)激相關(guān)凋亡途徑可能參與了心肌肥大及失代償?shù)恼{(diào)節(jié),決定肥大心肌失代償?shù)倪M(jìn)程。
　　 2 ER應(yīng)激誘導(dǎo)劑TG和TM誘導(dǎo)原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞肥大和顯著ER應(yīng)激
　　 上述實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ER應(yīng)激參與了腹主動(dòng)脈狹窄致大鼠心肌肥大的發(fā)生、發(fā)展過程,為證實(shí)ER應(yīng)激獨(dú)立誘導(dǎo)心肌肥大,本部分實(shí)驗(yàn)在原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞模型上,采用不同濃度TG處理原代培養(yǎng)心肌

9、細(xì)胞48h或50nmol/L TG分別處理心肌細(xì)胞12、24、36、48、60、72h；同時(shí)采用不同濃度TM分別處理心肌細(xì)胞48、72、96h；10-7mmol/L血管緊張素Ⅱ處理心肌細(xì)胞48h作為陽性對照。采用培養(yǎng)基乳酸脫氫酶活性和細(xì)胞凋亡率檢測反映心肌細(xì)胞損傷變化,RT-PCR技術(shù)觀察心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志性基因心房鈉尿肽和腦鈉肽mRNA表達(dá),3H-亮氨酸摻入技術(shù)檢測心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成速率,F-actin染色技術(shù)觀測心肌細(xì)胞骨架改變,同時(shí)

10、分析心肌細(xì)胞表面積變化。此外采用RT-PCR技術(shù)觀測ER應(yīng)激分子CRT、GRP78、PERK、ATF4和CHOP mRNA表達(dá),Western blot技術(shù)觀測CRT、GRP78、CHOP、Bax和Bcl-2蛋白水平改變,同時(shí)采用ER特異性熒光染料Dapoxyl觀察ER形態(tài)變化,免疫熒光技術(shù)觀察CRT熒光改變。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn),ER應(yīng)激誘導(dǎo)劑TG和TM以時(shí)間和劑量依賴性方式誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷,培養(yǎng)基LDH活性和細(xì)胞凋亡率顯著增加；

11、同時(shí)心肌細(xì)胞顯著肥大,表現(xiàn)為TG和TM以時(shí)間和劑量依賴性方式誘導(dǎo)ANP和BNPmRNA表達(dá)、蛋白合成速率和細(xì)胞表面積增加;F-actin染色表明TG和TM誘導(dǎo)心肌細(xì)胞骨架熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)、應(yīng)力纖維增加。而且發(fā)現(xiàn)50nmol/L TG作用48h和10ng/ml TM作用72h心肌細(xì)胞顯著肥大,細(xì)胞損傷較輕,是誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的較適條件。此外,TG以劑量和時(shí)間依賴性方式誘導(dǎo)培養(yǎng)心肌細(xì)胞顯著ER應(yīng)激,ER應(yīng)激分子CRT、GRP78表達(dá)顯著增加

12、；值得注意的是PERK和ATF4 mRNA表達(dá)于TG作用24-48h顯著增加,而在60-72h時(shí)顯著降低。嚴(yán)重ER應(yīng)激觸發(fā)細(xì)胞凋亡途徑,TG以劑量和時(shí)間依賴性方式促進(jìn)ER凋亡蛋白CHOP表達(dá)增加和Bcl-2/Bax比值顯著降低。心肌細(xì)胞ER染色顯示ER形態(tài)顯著擴(kuò)張,熒光顆粒分布不均、濃集并出現(xiàn)空泡。免疫熒光顯示TG作用后CRT熒光強(qiáng)度增強(qiáng)且向核周濃集。10ng/ml TM處理72h心肌細(xì)胞也證實(shí)上述ER應(yīng)激改變。上述結(jié)果提示ER應(yīng)激誘導(dǎo)

13、TG和TM誘導(dǎo)培養(yǎng)心肌細(xì)胞顯著肥大和ER應(yīng)激,而且CHOP凋亡途徑激活參與了ER應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。
　　 3 CaN-MEF2c信號途徑參與ER應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大過程
　　 ER是細(xì)胞內(nèi)重要的Ca2+處理器,細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高是觸發(fā)心肌細(xì)胞肥大的基本信號,而CaN可直接受細(xì)胞內(nèi)Ca2+調(diào)控,本部分實(shí)驗(yàn)旨在探討CaN-MEF2c信號途徑在ER應(yīng)激誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大過程中的作用。不同濃度TG處理原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞48h

14、或50nmol/L TG分別處理心肌細(xì)胞12、24、36、48、60、72h,同時(shí)采用10ng/ml TM處理心肌細(xì)胞72h。其次為觀察CaN預(yù)處理心肌細(xì)胞10min后繼而培養(yǎng)基內(nèi)加入50nmol/L TG作用48h。采用Fluo-3AM染色檢測心肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+水平,超微量Ca2+-ATP酶活性測試盒檢測肌漿網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣-ATPase活性,同時(shí)采用底物發(fā)色法檢測心肌細(xì)胞CaN活性,采用細(xì)胞凋亡率和培養(yǎng)基LDH活性檢測反映CaN活性

15、抑制后細(xì)胞損傷情況,采用ANP和BNP mRNA表達(dá)、蛋白合成速率和細(xì)胞表面積檢測評價(jià)CaN活性抑制后心肌細(xì)胞肥大變化。Western blot技術(shù)檢測心肌細(xì)胞SERCA、受磷蛋白、MEF2c、p-MEF2c以及CaN活性抑制后ER應(yīng)激分子CRT、GRP78、CHOP、Bax和Bcl-2等蛋白表達(dá),免疫熒光技術(shù)檢測MEF2c熒光改變.
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)ER應(yīng)激誘導(dǎo)劑TG以劑量和時(shí)間依賴性方式誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+水平升高,同時(shí)SE

16、RCA活性和表達(dá)降低、PLB表達(dá)增加；此外心肌細(xì)胞CaN活性和MEF2c/p-MEF2c蛋白表達(dá)顯著增加。TM作用心肌細(xì)胞也證實(shí)ER應(yīng)激誘導(dǎo)心肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+水平增加和SERCA活性降低,同時(shí)CaN活性升高。免疫熒光顯示正常心肌細(xì)胞MEF2c主要分布在細(xì)胞漿,TG作用后MEF2c向核內(nèi)轉(zhuǎn)位。CsA顯著抑制TG誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞CaN活性升高,同時(shí)阻斷TG誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大,表現(xiàn)為CsA顯著阻斷TG誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞ANP、BNP mRNA表

17、達(dá)、蛋白質(zhì)合成速率和細(xì)胞表面積增加。免疫熒光發(fā)現(xiàn)TG誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞MEF-2c表達(dá)和核轉(zhuǎn)位均顯著被CsA抑制。心肌細(xì)胞肥大抑制后細(xì)胞損傷顯著增加,細(xì)胞凋亡率和培養(yǎng)基LDH活性升高。此外發(fā)現(xiàn)CaN活性抑制沒有阻斷TG誘導(dǎo)的CRT、GRP78和CHOP表達(dá)增加。上述結(jié)果提示SERCA活性降低和PLB表達(dá)增加可能參與了心肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+增加,Ca2+可能通過激活CaN-MEF2c信號途徑參與ER應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大過程。心肌細(xì)胞肥大可能

18、是ER應(yīng)激損傷的代償性反應(yīng),CaN-MEF2c途徑阻斷顯著抑制ER應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大,導(dǎo)致細(xì)胞損傷增加,至少部分是通過CHOP介導(dǎo)的ER應(yīng)激凋亡途徑實(shí)現(xiàn)的。
　　 通過上述分析,得出如下實(shí)驗(yàn)結(jié)論:ER應(yīng)激不僅參與腹主動(dòng)脈狹窄致高血壓大鼠心肌肥大的發(fā)生、發(fā)展過程,而且獨(dú)立誘導(dǎo)培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞肥大發(fā)生,CaN-MEF2c信號途徑參與了ER應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大發(fā)生、發(fā)展過程,CaN活性抑制顯著阻斷ER應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大,同時(shí)