卵巢儲備功能不良女性GDF-9表達、基因變異和功能研究.pdf

1、卵巢儲備功能是指卵巢內(nèi)存留的卵泡數(shù)量和質(zhì)量,反映女性的生育潛能。卵巢產(chǎn)生卵子的能力減弱,卵母細胞質(zhì)量下降,稱為卵巢儲備不良或卵巢儲備功能下降,進一步可發(fā)展為卵巢早衰,極大威脅女性生殖健康。既往對卵巢儲備功能的研究主要集中于尋找出可以預測、評判卵巢功能的指標,然而關(guān)于卵巢功能下降的確切機制研究甚少。
　　 普遍認為年齡是影響卵巢功能的最重要因素。但是卵巢衰老發(fā)生存在極大的個體差異性,提示我們卵巢內(nèi)部因素比年齡更能決定生育儲備。卵泡

2、生長發(fā)育異常、顆粒凋亡加速導致卵泡閉鎖是卵巢儲備功能下降的根本原因。研究參與調(diào)節(jié)卵泡生長、閉鎖過程的基因?qū)τ诮沂韭殉矁涔δ芟陆档臋C制有著重要意義。目前認為卵母細胞源性生長因子對卵泡及周圍細胞發(fā)育發(fā)揮重要作用。
　　 生長分化因子-9(Growth Differentiatoin Factor-9,GDF-9)是第一個被發(fā)現(xiàn)的卵母細胞分泌因子,屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming Growth Factor-β,TGF

3、-β)超家族成員。已經(jīng)證實,GDF-9參與了卵泡生長、閉鎖；顆粒細胞增殖,凋亡；排卵發(fā)生；卵母細胞成熟；卵巢內(nèi)激素及細胞因子的分泌?；谠诼雅莅l(fā)育成熟過程中的重要作用,GDF-9被認為是卵泡發(fā)育異常相關(guān)疾病的重要候選基因,多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)表現(xiàn)出卵巢組織GDF-9蛋白表達顯著下降,卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)存在相關(guān)突變位點。而在異

4、卵雙胎母親也發(fā)現(xiàn)了GDF-9基因變異。提示GDF-+9在女性卵巢發(fā)育及排卵中具有重要作用。但是目前關(guān)于GDF-9基因與卵巢儲備功能方面的研究至今尚無報道。
　　 本研究擬從蛋白表達和基因水平著手,分析卵巢儲備功能不良女性GDF-9基因的表達、突變及其功能狀態(tài),以期揭示GDF-9蛋白分泌和基因異常介導卵巢儲備功能下降發(fā)生的可能分子機制,為拯救女性生育力提供理論基礎(chǔ)和新思路
　　 第一部分 GDF-9蛋白表達與卵巢儲備功能的

5、關(guān)系及其對顆粒細胞凋亡的調(diào)控
　　 目的:檢測卵巢儲備功能不良女性卵泡液GDF*9蛋白及顆粒細胞p53 mRNA表達水平,并進一步研究GDF-9蛋白對顆粒細胞凋亡的調(diào)節(jié)。
　　 方法:以68例卵巢低反應(yīng)患者為研究對象,同時以97例卵巢正常反應(yīng)者為對照組,Western Blot分析卵泡液中GDF-9表達與卵巢反應(yīng)性的關(guān)系,同時采用Real-time檢測卵巢低反應(yīng)患者顆粒細胞p35 mRNA表達。人黃素化顆進行原代培養(yǎng)粒細

6、胞,并給予不同濃度重組GDF-9(0-300ng／mL)刺激,Real-time檢測p53mRNA表達,Western Blot檢測p53蛋白水平表達。
　　 結(jié)果:1.卵巢低反應(yīng)患者卵泡液GDF-9蛋白表達水平顯著低于正常對照組,卵巢低反應(yīng)患者顆粒細胞p53 mRNA表達明顯高于正常對照組；2.給予原代培養(yǎng)顆粒細胞不同濃度GDF-9作用24h,隨GDF-9濃度的增加(Ong／ml,30ng／ml,100ng／ml,300ng／

7、ml),顆粒細胞p53 mRNA及蛋白表達水平均明顯下降。
　　 結(jié)論:1.卵泡液GDF-9蛋白水平下降與卵巢儲備功能下降相關(guān)；2.誘導顆粒細胞p53 mRNA表達上調(diào),促進顆粒細胞凋亡,加速卵泡閉鎖,可能降低的GDF-9蛋白水平參與卵巢儲備功能不良發(fā)生的機制之一。
　　 第二部分卵巢儲備功能不良女性GDF-9基因變異研究。
　　 目的:對卵巢儲備功能不良女性進行GDF-9基因篩查,分析其SNPs與卵巢儲備功能下

8、降的關(guān)系,并試圖揭示卵巢儲備功能不良導致女性生殖潛能下降的機制。
　　 方法:以106例卵巢儲備功能下降女性為研究對象,同時采集123例健康、卵巢功能正常的生育期女性外周血作為正常對照。利用直接測序法篩查卵巢儲備功下降女性GDF-9基因變異情況,分析SNPs基因型與卵巢儲備功能、IVF結(jié)局的關(guān)系。
　　 結(jié)果:1.直接測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)了2個已知的單核苷酸多態(tài):c.C447T,c.G546A；和2個新發(fā)突變:c.G169T(p

9、.D57Y),c.C436T(p.R164C)。2.對于GDF-9 G546A,GA／AA基因型頻率及A等位基因頻率在卵巢儲備下降女性中顯著高于正常對照組,而GDF-9 C447T基因型和等位基因頻率在兩組間沒有顯著性差異。3.卵巢儲備下降組中,與GG基因女性相比,攜帶GA／AA基因型女性其卵巢低反應(yīng)發(fā)生的風險顯著贈高,優(yōu)質(zhì)胚胎率和妊娠率顯著降低(p<0.01)。正常對照組中,GG和GA／AA基因型在這些指標間沒有顯著差異(p>0.05

10、)。GDF-9 C447T三種基因型在兩組IVF結(jié)局中沒有明顯差異(p>0.05)。4.2個新發(fā)現(xiàn)突變位點,其中p.R164C僅發(fā)生于卵巢儲備功能下降女性,而p.D57Y在卵巢儲備下降組和正常對照組均有發(fā)生,且發(fā)生頻率無明顯差異。
　　 結(jié)論:GDF-9 G546A與女性卵巢儲備功能不良密切相關(guān)。GA／AA基因型可能是導致卵巢儲備功能不良女性發(fā)生生殖潛能降低的機理之一。
　　 第三部分 GDF-9基因突變體的表達及功能研

11、究。
　　 目的:研究野生型和突變型GDF-9蛋白表達和生物學功能的差異,探討突變GDF-9基因引起卵巢儲備功能不良的發(fā)生機制。
　　 方法:利用分子克隆和定點突變技術(shù)構(gòu)建野生型真核表達質(zhì)粒pcDNA4-Myc／His-GDF-9wt和突變型真核表達質(zhì)粒pcDNA4-Myc／His—GDF-9D57Y,pcDNA4-Myc／His-GDF-9R164C,分別轉(zhuǎn)染HEK293T細胞,經(jīng)Zecoin篩選建立GDF-9穩(wěn)定表達

12、HEK239T細胞系,Western Blot分析野生型和突變型蛋白分泌情況。用野生型和突變型重組蛋白刺激原代培養(yǎng)人黃素化顆粒細胞,Alarm Blue研究突變型蛋白對刺激顆粒增殖能力的影響,Western Blot分析其對下游信號轉(zhuǎn)導分子Smad-2磷酸化水平的作用。
　　 結(jié)果:1.p.R164C僅發(fā)生于2例卵巢儲備下降患者,該位點高度保守。p.D57Y發(fā)生6例卵巢儲備下降患者,同時見于2例正常對照女性(p>0.05)。2.

13、Western Blot分析證實p.R164C導致成熟蛋白分泌顯著減少,突變蛋白刺激顆粒增殖以及誘導Smad-2磷酸化的能力明顯降低。p.D57Y突變不影響蛋白的分泌,并且突變蛋白對顆粒細胞和Smad-2的作用與野生型蛋白無明顯差異。
　　 結(jié)論:1.錯義突變p.R164C影響成熟蛋白分泌,使GDF-9蛋白刺激顆粒細胞增殖和誘導Smad-2磷酸化水平的能力下降。2.GDF-9基因突變導致的蛋白生物學活性下降可能是一部分卵巢儲備功