白三烯B4在巨噬細(xì)胞抗結(jié)核免疫中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、結(jié)核病(TB)仍然是全球范圍公共健康問(wèn)題，主要由結(jié)核分枝桿菌（Mtb）感染引起，Mtb是一種胞內(nèi)寄生菌，感染人體后主要居住在巨噬細(xì)胞內(nèi)，巨噬細(xì)胞作為吞噬Mtb的主要細(xì)胞在感染Mtb的機(jī)體固有免疫應(yīng)答中起主要作用，構(gòu)成機(jī)體防御的第一道防線(xiàn)，該細(xì)胞主要通過(guò)吞噬、生成自由基及多種細(xì)胞因子、細(xì)胞凋亡、抗原提呈等多種途徑殺滅Mtb。宿主抗Mtb感染的免疫機(jī)制復(fù)雜，眾多免疫相關(guān)的介質(zhì)參與其中，巨噬細(xì)胞是白三烯B4（LTB4）的主要來(lái)源之一，白三烯是

2、花生四烯酸通過(guò)5-脂氧合酶途徑代謝的產(chǎn)物，是有效的促炎脂質(zhì)介質(zhì)，研究表明 LTB4具有多重功能，可導(dǎo)致白細(xì)胞趨化、粘附、脫顆粒、細(xì)胞因子分泌，可以影響多種生物效應(yīng)，參與許多免疫性疾病的病理過(guò)程，如哮喘、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，在疾病的病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)LTB4在感染性疾病發(fā)揮的作用日益受到重視，包括寄生蟲(chóng)、細(xì)菌感染，但目前有關(guān)LTB4在結(jié)核感染中發(fā)揮的作用少有報(bào)道。本研究提出旨在探索如下問(wèn)題：結(jié)核感染是否促進(jìn)巨噬細(xì)胞表達(dá)LTB4，

3、白三烯B4對(duì)巨噬細(xì)胞抗結(jié)核免疫中發(fā)揮的作用以及可能的機(jī)制，期望為臨床抗結(jié)核病的輔助治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)一、結(jié)核分枝桿菌及其抗原成份對(duì)巨噬細(xì)胞LTB4表達(dá)的影響
　　目的：了解結(jié)核感染中引起巨噬細(xì)胞表達(dá)LTB4的成分。
　　方法：采用不同劑量結(jié)核重組抗原Ag85B、ESAT-6和菌株H37Ra及BCG與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)4、24h，留取培養(yǎng)上清，ELISA檢測(cè)LTB4表達(dá)量。
　　結(jié)果：在共培養(yǎng)4h、24h時(shí)間

4、段，巨噬細(xì)胞在結(jié)核及其抗原的刺激下均能生成LTB4，除H37Ra組外實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且LTB4的量分別隨Ag85B，ESAT-6量增多而增多，培養(yǎng)24h各組生成的白三烯B4量少于4h。
　　結(jié)論：BCG和結(jié)核分支桿菌分泌蛋白ESAT-6、Ag85B促進(jìn)巨噬細(xì)胞早期表達(dá)LTB4，而熱滅活H37Ra不能促進(jìn)巨噬細(xì)胞表達(dá)LTB4。
　　實(shí)驗(yàn)二、LTB4對(duì)巨噬細(xì)胞抗結(jié)核免疫的作用
　　目的：探索LTB4在巨噬

5、細(xì)胞感染Mtb過(guò)程中發(fā)揮的作用。
　　方法：采用改良抗酸染色方法確定THP-1吞噬現(xiàn)象，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)吞噬率；流式檢測(cè)LTB4對(duì)感染細(xì)胞活性氧的影響；酸性磷酸酶染色確定LTB4對(duì)溶酶體影響；流式檢測(cè)感染細(xì)胞凋亡率。
　　結(jié)果：
　?。?）比較加入LTB4后THP-1細(xì)胞對(duì)BCG的吞噬變化，在培養(yǎng)4h不同濃度外源性L(fǎng)TB4（1-100nM）都可以促進(jìn)吞噬，吞噬率隨劑量升高而升高，且這種作用可以被LTB4的BLT1

6、受體阻滯劑U75302抑制，培養(yǎng)24h無(wú)促吞噬作用。
　?。?）LTB4可以促進(jìn)細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生，并且可以提高感染細(xì)胞的活性氧。
　　（3）LTB4促進(jìn)感染細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論：白三烯B4可以促進(jìn)THP-1細(xì)胞吞噬Mtb，并通過(guò)產(chǎn)生活性氧和促進(jìn)細(xì)胞凋亡來(lái)影響巨噬細(xì)胞抗結(jié)核免疫作用。
　　實(shí)驗(yàn)三、探索LTB4對(duì)巨噬細(xì)胞抗結(jié)核免疫作用的機(jī)制
　　目的：探索LTB4影響巨噬細(xì)胞抗結(jié)核免疫可能的機(jī)制。
　　方

7、法：巨噬細(xì)胞和結(jié)核共培養(yǎng)4、24h，施加不同的干預(yù)措施，采用qPCR和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定感染結(jié)核的巨噬細(xì)胞TNF-α的mRNA及培養(yǎng)上清蛋白水平的表達(dá)，以及LTB4生成關(guān)鍵酶LTA4H的mRNA及LTB4表達(dá)水平。
　　結(jié)果：感染4h、24h，外源性L(fǎng)TB4對(duì)感染結(jié)核巨噬細(xì)胞TNF-α表達(dá)水平均無(wú)影響，但促進(jìn)其mRNA表達(dá)，4h后LTA4H生成抑制劑Bestatin下調(diào)TNF-α的mRNA水平，24h后LTB4受體抑制劑U753