GEF-H1在抗結(jié)核免疫應(yīng)答中的功能研究.pdf

1、結(jié)核病(tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染引起的、對(duì)人類公共健康危害最大的傳染病之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)統(tǒng)計(jì)，2015年新發(fā)結(jié)核病例1040萬(wàn)，其中48萬(wàn)為多重耐藥結(jié)核，10萬(wàn)人為利福平耐藥結(jié)核;結(jié)核致死人數(shù)高達(dá)140萬(wàn)，約19萬(wàn)人死于多重耐藥結(jié)核。由此可見(jiàn)，結(jié)核病對(duì)人類的生命健康威脅仍然十分嚴(yán)峻，

2、是亟待解決的全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題?？股亻L(zhǎng)期使用以及抗結(jié)核藥物使用的不合理，導(dǎo)致耐多藥結(jié)核菌株的產(chǎn)生和傳播;結(jié)核-HIV的聯(lián)合感染，使結(jié)核病的治療變得更加復(fù)雜和困難。深入研究MTB致病機(jī)制、免疫病理及免疫系統(tǒng)殺傷和清除MTB的機(jī)制，對(duì)尋找有效的抗結(jié)核治療和預(yù)防的新靶點(diǎn)，具有非常重要的意義。機(jī)體的免疫系統(tǒng)防御反應(yīng)在抵抗MTB感染中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。MTB被肺泡和間質(zhì)巨噬細(xì)胞、以及局部樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)識(shí)別時(shí)

3、，引發(fā)先天免疫應(yīng)答。巨噬細(xì)胞(macrophage，Mψ)是機(jī)體抗結(jié)核感染的第一道防線，通過(guò)表達(dá)Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)、免疫球蛋白受體、補(bǔ)體受體和凝集素受體等多種模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors，PRR)，與入侵的MTB相關(guān)抗原結(jié)合，從而介導(dǎo)MTB的粘附及吞噬，發(fā)揮胞內(nèi)殺菌效應(yīng)。
　　Ras同源家族的小鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白(The Rho family

4、 of smallGTP-binding proteins，Rho-GTPases)作為基本細(xì)胞活動(dòng)的分子開(kāi)關(guān)，通過(guò)結(jié)合GTP或GDP而發(fā)生活性與非活性狀態(tài)的改變，在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞遷移和粘附、活性氧形成和細(xì)胞凋亡中等多種細(xì)胞生命過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)控作用。鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factor,GEF)家族成員促進(jìn)GTP與GDP交換，是確保Rho-GTPases在特定空

5、間和時(shí)間激活的理想分子。在GEF家族中，鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子H1(GEF-H1)活性受微管結(jié)合的調(diào)節(jié)，從而參與細(xì)胞形變、p53腫瘤抑制基因的突變、細(xì)胞周期等生理生化過(guò)程。研究表明，GEF-H1的表達(dá)缺失或上調(diào)可調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、Rho家族成員之一RhoA活性及抗感染免疫反應(yīng)。然而，目前尚未見(jiàn)到GEF-H1調(diào)控被感染Mψ抵抗MTB感染的相關(guān)報(bào)道。
　　本課題探究了MTB感染Mψ后GEF-H1的表達(dá)變化及調(diào)節(jié)機(jī)制，并探討了GEF-H1

6、通過(guò)調(diào)控p38MAPK、TBK1通路，調(diào)節(jié)MTB感染Mψ中促炎因子表達(dá)，最終影響Mψ抑菌活性的機(jī)制，為進(jìn)一步研究GEF-H1在Mψ抗結(jié)核感染免疫中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為開(kāi)發(fā)通過(guò)GEF-H1調(diào)控Mψ抑菌活性的抗結(jié)核藥物提供了潛在靶點(diǎn)，對(duì)結(jié)核的有效防控具有重要意義。
　　目的:
　　1.確定GEF-H1與MTB感染的相關(guān)性，闡明MTB感染如何誘導(dǎo)GEF-H1表達(dá);
　　2.揭示GEF-H1對(duì)Mψ清除MTB的調(diào)控作用;

7、r>　　方法:
　　1.檢測(cè)MTB感染后GEF-H1的表達(dá)水平
　　a.采用采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）檢測(cè)MTB感染Mψ中GEF-H1的mRNA表達(dá)水平;
　　b.采用Western blot，檢測(cè)MTB感染Mψ中GEF-H1的蛋白表達(dá)水平。
　　2.研究MTB感染誘導(dǎo)GEF-H1表達(dá)增加的機(jī)制
　　a.采用多種信號(hào)通路抑制劑預(yù)處理Mψ后，Real-time PCR檢測(cè)Mψ中GEF

8、-H1的mRNA表達(dá)水平;
　　b.免疫熒光-激光掃描共聚焦顯微鏡觀察MTB感染Mψ中，GEF-H1與微管的共定位。
　　3.探討調(diào)節(jié)Mψ炎癥反應(yīng)及抑菌效應(yīng)的分子機(jī)制
　　a.采用siRNA沉默Mψ中GEF-H1的表達(dá);
　　b.通過(guò)平板菌落計(jì)數(shù)(CFU)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)沉默GEF-H1后MTB感染Mψ的抑菌活性;
　　c.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Mψ吞噬Texas-Red標(biāo)記BCG的能力;
　　d.Griess

9、法和Western blot檢測(cè)沉默GEF-H1后MTB感染Mψ的NO產(chǎn)生和自噬發(fā)生情況;
　　e.用Real-time PCR和ELISA檢測(cè)GEF-H1表達(dá)沉默對(duì)MTB感染Mψ促炎因子表達(dá)的調(diào)節(jié)效應(yīng);
　　f.Western blot檢測(cè)沉默GEF-H1后MTB感染Mψ的p38MAPK、TBK1通路活化;
　　g.G-LISA檢測(cè)沉默GEF-H1后MTB感染Mψ的RhoA活性。
　　結(jié)果:
　　1.MT

10、B感染Mψ細(xì)胞系后，GEF-H1的表達(dá)水平顯著上調(diào)，并呈時(shí)間及感染劑量依賴性。
　　2.MTB感染誘導(dǎo)的GEF-H1高表達(dá)依賴于p38、ERK、JNK及NF-κB信號(hào)通路，同時(shí)與MTB感染后微管的解聚有關(guān)。
　　3.MTB感染Mψ后，GEF-H1促進(jìn)Mψ吞噬及清除胞內(nèi)MTB。
　　4.MTB感染Mψ后，GEF-H1通過(guò)激活p38MAPK和TBK1信號(hào)通路促進(jìn)Mψ表達(dá)與分泌促炎細(xì)胞因子IL-6、IL-1β，從而發(fā)揮抑菌活