臍血CIK細(xì)胞對(duì)非霍奇金淋巴瘤的體外殺傷作用及機(jī)制的研究.pdf

1、目的:惡性淋巴瘤(malignant lymphoma,ML)是原發(fā)于淋巴結(jié)和(或)結(jié)外淋巴組織的惡性腫瘤,其發(fā)生大多與免疫應(yīng)答過(guò)程中淋巴細(xì)胞增殖分化產(chǎn)生的某種免疫細(xì)胞惡變有關(guān),是免疫系統(tǒng)的惡性腫瘤。由于遺傳因素、環(huán)境中物理及化學(xué)因素等的影響,兒童惡性淋巴瘤發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì),嚴(yán)重威脅著兒童的健康與生命。小兒惡性淋巴瘤無(wú)論在臨床表現(xiàn)、組織病理類型還是治療反應(yīng)上均與成人惡性淋巴瘤不同,有其獨(dú)特的生物學(xué)特性,如:潛伏期短、生長(zhǎng)迅速、侵襲性

2、強(qiáng)等。目前聯(lián)合化療仍是治療惡性淋巴瘤的主要手段,但化療的毒副作用以及多藥耐藥是影響患兒長(zhǎng)期生存的重要因素之一。多種靶向藥物的問(wèn)世如利妥昔單抗(Anti-CD20)、Anti-CD22單抗,它們的臨床應(yīng)用提高了B細(xì)胞型淋巴瘤的緩解率。T細(xì)胞型淋巴瘤目前尚未發(fā)現(xiàn)靶向藥物,臨床預(yù)后仍較差。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine-induced killer cells CIK)是一種新型的免疫活性細(xì)胞,是將人外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外多種細(xì)胞因

3、子刺激下,獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞,同時(shí)兼具有T淋巴細(xì)胞的強(qiáng)大抗瘤活性和自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell NK)的非主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complexMHC)限制殺瘤兩種特點(diǎn)。Survivin是凋亡蛋白抑制劑(Inhibitor of apoptosis protein,lAP)家族中的成員之一,具有抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和分裂的功能。Livin是最近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)凋亡抑

4、制蛋白家族的新成員,是獨(dú)立于Bcl-2的抗凋亡蛋白。Livin主要存在于細(xì)胞質(zhì)中,且以絲狀形式表達(dá),同時(shí)也在細(xì)胞核中表達(dá)。Livin是通過(guò)以下途徑來(lái)完成抗凋亡作用的:
　　 ①通過(guò)拮抗死亡受體途徑;
　　 ②抗化療藥物介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用;
　　 ③抗線粒體介導(dǎo)的凋亡作用。
　　 Livin可以通過(guò)直接與Caspases結(jié)合來(lái)抑制其活性,拮抗細(xì)胞凋亡,還可以分解Smac,從而阻止其對(duì)XIAP的拮抗作用,間接

5、抑制Caspases來(lái)調(diào)控細(xì)胞的凋亡。研究表明,Livin在正常成人組織如脾、胸腺、前列腺、睪丸、小腸、結(jié)腸、卵巢、肝、肺、腦、骨骼肌和淋巴細(xì)胞以及外周血中不表達(dá)或低表達(dá),大多數(shù)腫瘤中高表達(dá),如肺癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、前列腺癌、膀胱癌、胃癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤和白血病等。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究臍血CIK細(xì)胞對(duì)Livin、Survivin的影響進(jìn)而研究其抗腫瘤作用可能的分子機(jī)制,為臍血CIK細(xì)胞治療惡性淋巴瘤的臨床應(yīng)用提供理論

6、依據(jù)。
　　 方法:體外培養(yǎng)T細(xì)胞淋巴瘤Jurkat細(xì)胞及臍血CIK細(xì)胞,分為阿糖胞苷組、臍血CIK細(xì)胞組、阿糖胞苷聯(lián)合臍血CIK細(xì)胞組、對(duì)照組。應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞特異性凋亡蛋白Livin、Survivin mRNA的表達(dá)水平;MTT比色法檢測(cè)殺傷率;流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)培養(yǎng)臍血CIK細(xì)胞的上清液與Jurkat細(xì)胞作用后的凋亡情況。
　　 計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((X)±S)表示,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS13

7、.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組均數(shù)的比較行單因素方差分析(ANOVA),各組間兩兩比較采用SNK法(Student-Newman-Keuls),檢驗(yàn)水平α=0.05,P＜0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:CIK細(xì)胞、阿糖胞苷作用于Jurkat細(xì)胞24h、48h后,腫瘤細(xì)胞的特異性凋亡抑制因子Livin、Survivin的mRNA表達(dá)量均低于對(duì)照組,其中CIK細(xì)胞聯(lián)合阿糖胞苷組

8、明顯低于對(duì)照組,且48h后各實(shí)驗(yàn)組Livin-αA值/β-actin A值、Livin-βA值/β-actinA值、SurvivinA值/β-actin A值均小于24h的比值(A為電泳條帶的灰度值)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。說(shuō)明CIK細(xì)胞通過(guò)下調(diào)凋亡抑制因子Livin、Survivin的mRNA表達(dá)來(lái)促進(jìn)Jurkat細(xì)胞的凋亡,并呈時(shí)間依賴性。
　　 2、MTT比色試驗(yàn)結(jié)果顯示:預(yù)實(shí)驗(yàn)CIK細(xì)胞與Jurkat細(xì)胞效靶比5

9、∶1、10∶1、15∶1、20∶1作用12、24,48h后,與對(duì)照組相比,各組吸光度值(OD)均有不同程度的下降。各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。即CIK細(xì)胞作用于Jurkat細(xì)胞后隨著效靶比增高及作用時(shí)間的延長(zhǎng),CIK細(xì)胞對(duì)Jurkat的殺傷作用逐漸增強(qiáng),呈濃度-時(shí)間依賴性。實(shí)驗(yàn)組顯示阿糖胞苷10μmol/L、CIK細(xì)胞(效靶比:20∶1)、阿糖胞苷10μmol/L聯(lián)合CIK細(xì)胞(效靶比:20∶1),各組吸光度(O

10、D)均有不同程度的下降,其中阿糖胞苷聯(lián)合CIK細(xì)胞組吸光度下降最明顯,各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),殺傷率的計(jì)算結(jié)果顯示阿糖胞苷聯(lián)合臍血-CIK組最高達(dá)(61.23±4.6)％,是單用阿糖胞苷的1.41倍,是單用CIK組的1.34倍(P＜0.05)。
　　 3、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示:鏡下觀察見(jiàn)Jurkat細(xì)胞,與CIK細(xì)胞上清液共同培養(yǎng)12h后,有少部分淋巴瘤細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、凋亡,而24h后出現(xiàn)凋亡峰,48h后

11、淋巴瘤細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增多,對(duì)照組未出現(xiàn)凋亡峰。與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞凋亡率顯著增高(P＜0.05),24h凋亡率為(31.2±2.9)％,48h凋亡率為(38.6±3.6)％,實(shí)驗(yàn)組間比較,隨作用時(shí)間的延長(zhǎng),凋亡率呈上升趨勢(shì),組間差異顯著(P＜0.05)。表明CIK細(xì)胞可通過(guò)釋放到胞外的各種細(xì)胞因子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)殺傷腫瘤細(xì)胞,且呈時(shí)間依賴性。
　　 結(jié)論:
　　 1、臍血CIK細(xì)胞能夠誘導(dǎo)淋巴瘤Jurkat細(xì)胞凋亡

12、,并可使Jurkat細(xì)胞中Livin、Survivin mRNA的表達(dá)下降,并呈明顯的時(shí)間依賴關(guān)系,認(rèn)為臍血CIK通過(guò)下調(diào)Livin、Survivin的表達(dá)來(lái)促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞的凋亡。
　　 2、臍血CIK細(xì)胞體外對(duì)T淋巴瘤細(xì)胞(Jurkat細(xì)胞株)生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用,且在效靶比在5∶1-20∶1范圍內(nèi)呈時(shí)間、劑量依賴性。
　　 3、臍血CIK細(xì)胞通過(guò)釋放細(xì)胞因子來(lái)誘導(dǎo)殺傷Jurkat細(xì)胞,且呈時(shí)間依賴性。