堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子緩釋微球?qū)ν孟ス顷P(guān)節(jié)炎治療作用及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的：骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨損傷為特點(diǎn)的、原因不明的慢性退行性疾病。OA是全球分布最廣、最為流行的疾病之一，嚴(yán)重影響了患者的日常和社會(huì)生活。OA的主要病理改變?yōu)殛P(guān)節(jié)軟骨的損傷、退變及軟骨下骨的硬化、增生、囊變，繼而導(dǎo)致關(guān)節(jié)間隙狹窄。關(guān)節(jié)軟骨是成熟的透明軟骨沒有血管和修復(fù)細(xì)胞，軟骨細(xì)胞的分裂潛能及其修復(fù)能力非常有限，當(dāng)關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生嚴(yán)重退行性變時(shí)進(jìn)行治療很困難。目前OA的保守治療方法雖然很多，但是治療

2、效果都有限。對(duì)于嚴(yán)重OA的病例只能采用人工關(guān)節(jié)置換來治療，然而關(guān)節(jié)置換術(shù)存在著諸如年齡、手術(shù)損傷大、費(fèi)用高、長(zhǎng)期預(yù)后、再次翻修等一系列問題。因此尋找有效的保守治療骨關(guān)節(jié)炎的方法至關(guān)重要。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth Ncmr，bFGF)是最有效的體外軟骨細(xì)胞分裂素之一，具有加速軟骨代謝，促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨再生的作用，但bFGF體內(nèi)半衰期很短僅為3～5min，全身或局部應(yīng)用的效果均不能滿足臨床上治療需要

3、。因此應(yīng)用bFGF緩釋制劑對(duì)長(zhǎng)期維持損傷局部的有效藥物濃度有重要意義。目前研究發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨組織中的基質(zhì)金屬蛋白酶-13(matrix metalloproteinases-13，MMP-13)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(tissue inhibitors of metallomatrixo1,TIMP-1)可調(diào)控軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解，參與關(guān)節(jié)軟骨的損傷過程。 因此，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用殼聚糖包被bFGF制作緩釋微球以長(zhǎng)時(shí)間維持關(guān)節(jié)內(nèi)

4、的有效藥物濃度，并觀察其抑制OA進(jìn)展的作用及其對(duì)MMP-13、TMP-1 mRNA表達(dá)的影響。探討bFGF持續(xù)釋放對(duì)實(shí)驗(yàn)性兔膝關(guān)節(jié)OA的治療作用的部分作用機(jī)制。方法：健康成年新西蘭大白兔54只隨機(jī)選取9只作為對(duì)照組，其余45只作為實(shí)驗(yàn)組給予實(shí)驗(yàn)干預(yù)。于兔雙后腿膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射木瓜蛋白酶建立兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型，將其隨機(jī)分為5組，每組9只，分別為模型組、PBS微球組(PBS-M)、bFGF溶液組(bFGF-S)、10μgbFGF微球組(10-b

5、FGF-M)及100μg bFGF微球組(100-bFGF-M)。用殼聚糖制成含PBS及含bFGF的緩釋微球，干凍保存?zhèn)溆谩７謩e于第3周及第6周兩次于各治療組動(dòng)物關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射溶液或微球，于第9周處死動(dòng)物后取材。肉眼觀察兔軟骨組織大體形態(tài)，采用印度Ink評(píng)分法比較各組動(dòng)物大體軟骨損傷程度；通過HE染色及PAS染色方法觀察軟骨組織病理改變，采用Mankin評(píng)分系統(tǒng)評(píng)價(jià)；應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨組織MMP-13、TMP-1 mRN

6、A表達(dá)變化。 結(jié)果： 1.微球的外觀形態(tài)及粒徑分布光學(xué)及電子顯微鏡觀察到殼聚糖微球外觀圓整，粒徑分布均勻，大部分微球粒徑分布在3～7μm范圍內(nèi)，平均粒徑為4.69±0.06μm。 2.各組關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本Ink評(píng)分結(jié)果：與對(duì)照組相比，模型組關(guān)節(jié)軟骨損傷程度明顯加重(3.38±0.65 vs.0.15±0.37，P＜0.05)：PBS-M組、bFGF-S組與模型組相比，關(guān)節(jié)軟骨損傷程度無明顯減輕(3.08±0.64，3

7、.31±0.63 vs.3.38±0.65，P值均＞0.05)，而10-bFGF-M組和100-bFGF-M組關(guān)節(jié)軟骨損傷程度較模型組明顯減輕(1.92±0.49，1.3 1±0.48 vs.3.38±0.65，P值均＜0.05)。并且100-bFGF-M組與10-bFGF-M組相比關(guān)節(jié)軟骨損傷程度明顯減輕(1.31±40.48 vs.1.92±0.49，P＜0.05)。 3 各組關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本鏡下Mankin評(píng)分結(jié)果：與對(duì)照組相比，模型

8、組關(guān)節(jié)軟骨損傷程度明顯加重(13.08±0.64 vs。0.53±0.51.P＜0.05)；bFGF-S組、PBS-M組與模型組相比，關(guān)節(jié)軟骨損傷程度無明顯減輕(12.15±1.07，12.85±0.80 vs。13.08±0.64.P值均＞0.05)，而關(guān)節(jié)軟骨損傷程度較模型組明顯減輕(8.08±0.49，5.85±0.69 vs.13.08±0.64，P值均＜0.05)，100-bFGF-M組與10-bFGF-M組相比關(guān)節(jié)軟骨損傷程

9、度明顯減輕(5.85±0.69 vs.8.08±0.49，P＜0.05)。 4 關(guān)節(jié)軟骨組織MMP-13、TIMP-1mRNA表達(dá)改變：與對(duì)照組相比，模型組MMP-13 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，TIMP-1 mRNA表達(dá)明顯下降(P值均＜0.05)。PBS-M組、bFGF-S組MMP-13、TIMP-1mRNA表達(dá)與模型組比較無明顯差異(P值均＞0.05)，10-bFGF.M組和100-bFGF-M組較模型組MMP-13 mRNA

10、表達(dá)明顯下降，TIMP-1 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P值均＜0.05)。并且100-bFGF-M組較10-bFGF-M組MMP-13 mRNA表達(dá)明顯下降，TIMP-1 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P值均＜0.05)。 結(jié)論： 1.關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射木瓜蛋白酶，可建立膝骨關(guān)節(jié)炎模型。用沉淀/凝聚法成功制備bFGF殼聚糖微球。 2.殼聚糖包被bFGF與單純bFGF溶液注射組相比，具有明顯減輕兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨損傷的作用，提示本實(shí)驗(yàn)