補(bǔ)腎中藥聯(lián)合BMP-2對(duì)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞體外增殖及成骨活性影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：建立人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(UCB-MSCs)的體外分離培養(yǎng)體系，觀察體外分離培養(yǎng)UCB-MSCs的生物學(xué)特性及補(bǔ)腎中藥血清聯(lián)合BMP-2對(duì)體外培養(yǎng)UCB-MSCs增殖、堿性磷酸酶(ALP)及骨鈣素(BGP)表達(dá)的影響，探討其對(duì)UCB-MSCs向成骨細(xì)胞分化的誘導(dǎo)作用。
　　 方法：取18只SD大鼠，補(bǔ)腎中藥連續(xù)灌胃7天，頸總動(dòng)脈取血制備補(bǔ)腎中藥血清，采集人臍血標(biāo)本，密度梯度離心法分離UCB-MSCs，倒置相差顯微鏡下觀察原代

2、培養(yǎng)的UCB-MSCs生物學(xué)特性，并經(jīng)流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞鑒定。取第3代UCB-MSCs隨機(jī)分為4組，即A組（對(duì)照組）、B組（5％補(bǔ)腎中藥血清組）、C組（50ng/mlBMP-2組）、D組(5%補(bǔ)腎中藥血清+50ng/mlBMP-2組)。分別于誘導(dǎo)第1、3、5dMTT法觀察各組對(duì)UCB-MSCs增殖的影響；第3、6、9、12d通過ALP染色及活性檢測(cè)、骨鈣素(BGP)含量檢測(cè)觀察補(bǔ)腎中藥血清聯(lián)合BMP-2對(duì)UCB-MSCs成骨活性表達(dá)的影

3、響。
　　 結(jié)果：①原代培養(yǎng)的UCB-MSCs呈圓形，原代培養(yǎng)72h僅見少量貼壁細(xì)胞，近似圓形或橢圓形，7d首次換液可見分散的MSCs小集落，呈放射狀生長(zhǎng)。2周時(shí)細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)梭形,3周時(shí)細(xì)胞集落彼此融合。傳代細(xì)胞大部分24h內(nèi)貼壁，一般3d即可達(dá)到80%-90%融合，細(xì)胞排列緊密，形態(tài)較均一，以梭形為主。
　　 ②誘導(dǎo)培養(yǎng)第3、5d時(shí)，與對(duì)照組相比，補(bǔ)腎中藥血清聯(lián)合BMP-2組、BMP-2組均能夠促進(jìn)UCB-MSCs的增

4、殖(P＜0.05)，尤以補(bǔ)腎中藥血清聯(lián)合BMP-2組為最佳(P＜0.01)；第5天補(bǔ)腎中藥血清聯(lián)合BMP-2組與BMP-2組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.041＜0.05)，而單獨(dú)補(bǔ)腎中藥血清組與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 ③各誘導(dǎo)組第7dALP染色陽性表達(dá)較弱，第14dALP染色陽性增強(qiáng)，但各組強(qiáng)弱不等，其中對(duì)照組陽性表達(dá)較弱，補(bǔ)腎中藥血清聯(lián)合BMP-2組及BMP-2組較為顯著，而聯(lián)合組陽性表達(dá)最優(yōu)，第

5、21d染色陽性表達(dá)有所減弱。
　　 ④與對(duì)照組比較，補(bǔ)腎中藥血清聯(lián)合BMP-2組、BMP-2組在誘導(dǎo)后3、6、9、12d均能提高ALP活性(P＜0.05)，其中補(bǔ)腎中藥血清聯(lián)合BMP-2組在誘導(dǎo)后3、6、9dALP活性與對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.01)；補(bǔ)腎中藥血清聯(lián)合BMP-2組在誘導(dǎo)第6d時(shí)ALP活性與BMP-2組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=O.011＜0.05）。
　　 ⑤與對(duì)照組比較，BMP-2組、補(bǔ)腎中藥

6、血清聯(lián)合BMP-2組在誘導(dǎo)后6、9、12d均能提高細(xì)胞上清液中骨鈣素(BGP)含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其中，補(bǔ)腎中藥血清聯(lián)合BMP-2組在誘導(dǎo)第9d時(shí)BGP含量與對(duì)照組比較差異有顯著性意義(P=0.004＜0.01)。
　　 結(jié)論：基于“腎主骨、生髓”理論的補(bǔ)腎中藥血清聯(lián)合BMP-2體外誘導(dǎo)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞定向成骨分化的方法有效可行，二者能明顯促進(jìn)UCB-MSCs增殖與定向成骨分化，而單純補(bǔ)腎中藥血清此作用并不