缺氧條件下腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞的相互影響.pdf

1、研究背景： 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSC)是來源于骨髓的成體干細(xì)胞，具有多潛能分化性，已證明MSC修復(fù)和分化為多種組織的能力，尤其在修復(fù)和重建血管方面成為缺血性疾病治療研究的熱點(diǎn)。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brainmicrovascularendothelialcells，BMEC)是構(gòu)成血腦屏障的最主要組成部分，具有細(xì)胞間緊密連接、極少的胞飲囊泡和維持神經(jīng)組織離子和代謝穩(wěn)定的特殊跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)等獨(dú)

2、有生理特點(diǎn)。在缺血性腦血管疾病中，BMEC的損傷是導(dǎo)致血腦屏障開放、腦水腫發(fā)生，從而加重神經(jīng)元細(xì)胞損傷的重要因素，同時(shí)缺血半暗區(qū)腦微血管的修復(fù)與新生也是挽救缺血受損神經(jīng)元的關(guān)鍵。當(dāng)前，在干細(xì)胞治療缺血性腦血管病的研究方面，多數(shù)研究聚焦于干細(xì)胞修復(fù)受損的神經(jīng)組織，然而在干細(xì)胞對(duì)腦缺血部位受損的血腦屏障和微血管內(nèi)皮細(xì)胞影響的研究并未深入。本實(shí)驗(yàn)以缺氧條件下培養(yǎng)BMEC模擬缺血性腦血管疾病中血腦屏障和腦微血管所處的病理生理環(huán)境，觀察BMEC對(duì)

3、共培養(yǎng)的MSC分化的影響，以及MSC以旁分泌方式對(duì)BMEC增殖、遷移和血腦屏障模型通透性的影響，為MSC應(yīng)用于缺血性腦血管疾病的治療提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究目的： 1.分離、培養(yǎng)及鑒定大鼠BMEC和人骨髓MSC，建立缺氧條件下BMEC與MSC直接與間接共培養(yǎng)的模型，觀察缺氧條件下BMEC對(duì)直接與間接共培養(yǎng)的MSC分化的影響。 2.測(cè)定MSC與BMEC條件培養(yǎng)液中血管內(nèi)皮生長因子(vascularendotheli

4、algrowthfactor，VEGF)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrixmetalloproteinases-9，MMP-9)含量，觀察缺氧條件下MSC以旁分泌方式對(duì)BMEC增殖、遷移及其單層通透性的影響。 研究方法： 1.分離、培養(yǎng)及鑒定大鼠BMEC和人骨髓MSC：采用兩次酶消化法(0.1％Ⅱ型膠原酶，0.1％膠原酶/分散酶)和密度梯度離心法得到純化的腦微血管片段，加入含10ng/mlbFGF、20％胎牛血清和100

5、μg/ml肝素鈉的DMEM高糖完全培養(yǎng)液，接種于涂布Ⅳ型膠原和纖連蛋白的塑料培養(yǎng)瓶，免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法鑒定BMEC的vWF表達(dá)；用密度梯度離心法分離人骨髓MSC，采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定MSC的CD29、CD34、CD44、CD105和Flk-1表達(dá)。建立缺氧條件下BMEC與MSC直接與間接共培養(yǎng)的模型：缺氧實(shí)驗(yàn)在37℃、93％N2、5％CO2、2％O2的缺氧培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行；間接共培養(yǎng)使用孔徑0.4μm的MillicellCulturePlat

6、eInserts，BMEC以10％胎牛血清的DMEM低糖(DMEM-10)接種于上層(5x103/well)，將MSC以DMEM-10接種于下層24孔板內(nèi)(5×103/well)；直接共培養(yǎng)將兩種細(xì)胞以5000:5000cells/ml的比率混合于DMEM-10后接種于培養(yǎng)瓶或蓋玻片上。觀察缺氧條件下BMEC對(duì)共培養(yǎng)的MSC分化的影響：分別將直接和間接共培養(yǎng)的細(xì)胞在正常和缺氧條件下培養(yǎng)5天，采用流式細(xì)胞術(shù)(定量檢測(cè)Flk-1)和免疫熒光

7、細(xì)胞化學(xué)法(定性檢測(cè)Flk-1和vWF)對(duì)MSC的分化程度進(jìn)行分析。 2.①測(cè)定MSC與BMEC條件培養(yǎng)液中VEGF和MMP-9含量：收集正常和缺氧條件下兩種細(xì)胞的條件培養(yǎng)基得到正常的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基(BMECCMN)、間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基(MSCCMN)，以及缺氧條件下腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基(BMECCMH)、間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基(MSCCMH)，用ELISA檢測(cè)各條件培養(yǎng)基中VEGF和MMP-9的含量；②觀

8、察各條件培養(yǎng)基對(duì)BMEC增殖和遷移的影響：使用六種不同培養(yǎng)基(DMEM-10、MSCCMN、MSCCMH煮沸的MSCCMH培養(yǎng)基、添加抗VEGF抗體和MMP-9抑制劑Ⅰ的MSCCMH對(duì)BMEC進(jìn)行培養(yǎng)，采用CellCountingKit-8方法檢測(cè)各條件培養(yǎng)基對(duì)BMEC增殖的影響，采用Transwell培養(yǎng)體系檢測(cè)各條件培養(yǎng)基對(duì)BMEC遷移的影響；③觀察各條件培養(yǎng)基對(duì)BMEC單層通透性的影響：使用MilliCell-ERSVoltohm

9、meter測(cè)量不同條件培養(yǎng)基(DMEM-10、MSCCMN、MSCCMH、含VEGF抗體的MSCCMH和含MMP-9抑制劑Ⅰ的MSCCMH)對(duì)BMEC單層通透性的影響。 結(jié)果： 1.流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明MSC呈CD29、CD44、CD105陽性表達(dá)，CD34和Flk-1陰性表達(dá)；免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)BMEC呈vWF陽性表達(dá)。常氧和缺氧條件下的間接和直接共培養(yǎng)的細(xì)胞均能良好生長。常氧條件下間接共培養(yǎng)MSC的Flk-1和

10、vWF蛋白均為陰性表達(dá)。缺氧條件下間接共培養(yǎng)的(7.58±0.58)％(n=6，P=0.034)MSC開始表達(dá)Flk-1蛋白，激光共聚焦顯微鏡也顯示少量細(xì)胞開始出現(xiàn)紅色熒光，但未見綠色熒光的vWF蛋白表達(dá)。正常和缺氧條件下直接共培養(yǎng)5d時(shí)，開始表達(dá)Flk-1蛋白的MSC分別占共培養(yǎng)混合細(xì)胞數(shù)的(13.76±1.67)％(n=6，P＜0.001)和(23.64±2.50)％(n=6，P＜0.001)，兩者相比有顯著性差異(n=6，P＜0.

11、001)；激光共聚焦也顯示部分MSC開始表達(dá)Flk-1，而在常氧共培養(yǎng)細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)Flk-1陽性的細(xì)胞同時(shí)表達(dá)vWF，值得關(guān)注的是，缺氧直接共培養(yǎng)的混合細(xì)胞中，部分Flk-1陽性細(xì)胞開始同時(shí)表達(dá)vWF的綠色熒光。 2.①ELISA檢測(cè)條件培養(yǎng)基中VEGF、MMP-9的含量：缺氧導(dǎo)致BMEC和MSC條件培養(yǎng)基中VEGF含量均明顯增高；MSCCMH中VEGF含量明顯高于BMECCMH；BMECCMN中未檢測(cè)到MMP-9，MSCCMH

12、中MMP-9含量明顯高于MSCCMN和BMECCMH。②條件培養(yǎng)基對(duì)BMEC增殖和遷移的影響：與DMEM-10相比，MSCCMN明顯增強(qiáng)了BMEC的增殖，而MSCCMH對(duì)BMEC的增殖作用又明顯強(qiáng)于MSCCMN(0.947±0.103與0.532±0.028，P＜0.001，n=6)；MSCCMH促增殖作用因煮沸而完全喪失，同時(shí)VEGF的阻斷抗體可明顯抑制MSCCMH對(duì)BMEC的增殖作用(0.947±0.103與0.419±0.034，

13、P＜0.001，n=6)，而MMP-9抑制劑對(duì)BMEC的增殖影響不明顯(0.947±0.103與0.902±0.065，P=0.963，n=6)。與DMEM-10對(duì)照相比，MSCCMN明顯增多了BMEC遷移細(xì)胞的數(shù)量，而MSCCMH對(duì)BMEC的遷移作用又明顯強(qiáng)于MSCCMN(238±27與154±24，P＜0.01，n=6)；VEGF的阻斷抗體可明顯抑制MSCCMH對(duì)BMEC的遷移作用(238±27與150±20，P＜0.001，n=6

14、)，而MMP-9抑制劑對(duì)BMEC的遷移的抑制則更為明顯(238±27與106±18，P＜0.001，n=6)；與對(duì)增殖的影響類似，MSCCMH促遷移作用經(jīng)煮沸處理而完全喪失。③檢測(cè)24h內(nèi)不同條件培養(yǎng)基對(duì)內(nèi)皮單層通透性的影響：常氧條件下DMEM-10培養(yǎng)的BMEC電阻值在24h內(nèi)保持在較穩(wěn)定范圍內(nèi)，缺氧狀態(tài)DMEM-10培養(yǎng)BMEC的電阻值在缺氧6～18h內(nèi)出現(xiàn)明顯下降，約在18h達(dá)到最低為處理前的(77.2±1.8)％；缺氧狀態(tài)MSC

15、CMH培養(yǎng)的BMEC的電阻值在2h內(nèi)出現(xiàn)急劇增大，約在2h達(dá)到最低，為處理前的(50.5±2.6)％，在隨后的2～24h電阻值略有回升但仍處于較低水平；抗VEGF抗體和MMP-9抑制劑Ⅰ使MSCCMH培養(yǎng)的BMEC電阻值下降明顯趨緩，最低電阻值分別為處理前的(60.3±3.6)％和(76.0±2.4)％。 結(jié)論： 1.常氧條件下BMEC僅通過旁分泌細(xì)胞因子不足以誘導(dǎo)MSC分化，BMEC能夠通過細(xì)胞直接接觸誘導(dǎo)共培養(yǎng)的MS

16、C向內(nèi)皮分化，缺氧在誘導(dǎo)MSC向內(nèi)皮分化的過程中發(fā)揮重要作用，缺氧條件下，直接共培養(yǎng)的BMEC能誘導(dǎo)更多的MSC更徹底地向內(nèi)皮分化。 2.①M(fèi)SC條件培養(yǎng)基中MMP-9和VEGF的含量均明顯高于BMEC條件培養(yǎng)基，缺氧可介導(dǎo)BMEC和MSC條件培養(yǎng)基中MMP-9和VEGF的含量明顯升高。②MSC可通過旁分泌方式促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，MMP-9在MSC以旁分泌方式促進(jìn)BMEC遷移過程中發(fā)揮了重要作用，而VEGF則同時(shí)在促進(jìn)BM