成年大鼠許旺細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相互影響的體外研究.pdf

1、目的：許旺細(xì)胞(Schwann Cells，SCs)是周圍神經(jīng)的主要結(jié)構(gòu)和功能細(xì)胞，神經(jīng)損傷后它對(duì)神經(jīng)的再生和功能的恢復(fù)起著重要的作用，是臨床修復(fù)周圍神經(jīng)缺損的種子細(xì)胞。為了避免免疫排斥反應(yīng)，臨床需要自體來源的SCs，但是自體來源的SCs數(shù)量少，體外擴(kuò)增速度慢，培養(yǎng)條件高，長(zhǎng)期傳代增殖后SCs純度下降、細(xì)胞活性下降，不能滿足臨床需要。因此，有必要探索促進(jìn)SCs增殖的實(shí)驗(yàn)條件。骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Stromal Ce

2、lls，BMSCs)取材方便、易分離、體外培養(yǎng)增殖速度快；能在體外、體內(nèi)分化成熟，移植后保持生物學(xué)活性，并與組織工程材料有良好的相容性；移植入損傷的周圍神經(jīng)后能夠改善神經(jīng)再生環(huán)境，基本滿足種子細(xì)胞的要求，然而BMSCs在體內(nèi)生物誘導(dǎo)和體外化學(xué)誘導(dǎo)后分化的穩(wěn)定性不夠，在細(xì)胞移植修復(fù)周圍神經(jīng)損傷中作用時(shí)間有限，與宿主組織的整合還不能滿足臨床的需求，因此，仍需要進(jìn)一步研究BMSCs在各種創(chuàng)傷修復(fù)中的機(jī)制，研究促進(jìn)BMSCs向宿主靶細(xì)胞分化的方

3、法。綜上所述，周圍神經(jīng)缺損后的再生修復(fù)一直是顯微外科和神經(jīng)科學(xué)關(guān)注的問題，SCs作為首選的種子細(xì)胞在臨床應(yīng)用上存在不足而受到限制；而BMSCs在修復(fù)周圍神經(jīng)損傷方面表現(xiàn)出了巨大的潛能，但其特定分化成許旺細(xì)胞，促進(jìn)神經(jīng)再生的潛力還有待挖掘。本項(xiàng)目主要研究獲得足夠量和高純度成體SCs的實(shí)驗(yàn)方法；研究共培養(yǎng)體系中成體BMSCs和SCs能否互相促進(jìn)、提升彼此作為“種子細(xì)胞”的潛能，探究將這兩種成體細(xì)胞共同作為“種子細(xì)胞”治療神經(jīng)損傷的可能。為此

4、，我們?cè)O(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn)，在體外建立成年大鼠SCs和BMSCs共培養(yǎng)體系，觀察BMSCs的定向分化能力和SCs的存活增殖情況。旨在為細(xì)胞移植和“組織工程化神經(jīng)”修復(fù)周圍神經(jīng)缺損提供最佳的種子細(xì)胞。 實(shí)驗(yàn)方法： 1.取Wallerian變性一周成年SD大鼠雙側(cè)遠(yuǎn)側(cè)端的坐骨神經(jīng)和近側(cè)端神經(jīng)瘤，使用膠原酶／中性蛋白酶雙酶消化法分離SCs，用含10％胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)，1％Penicillin／

5、Streptomycin，2μmol／L forskolin,20 mg/L Pituitary Extract Bovine(BPE)的DMEM／F12培養(yǎng)液在37℃、5％CO2和95％濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)80％-90％融合時(shí)用于共培養(yǎng)。 2.從成年SD大鼠兩側(cè)股骨取材，用全骨髓貼壁法在含10％FBS，2μmol/L L-Glutamine，10ng／ml EGF，1％Penicillin／Streptomycin

6、的DMEM／F12培養(yǎng)液，37℃、5％CO2和95％濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)BMSCs，待細(xì)胞達(dá)80％-90％融合時(shí)，進(jìn)行連續(xù)傳代，獲得P10代BMSCs用于共培養(yǎng)。 3.使用插入式培養(yǎng)皿Millicell-HA和六孔板建立共培養(yǎng)體系，使BMSCs和SCs不能相互接觸但是共用相同的培養(yǎng)液。采用以下兩種共培養(yǎng)方法：①取P10代BMSCs，消化后以1×105密度接種于下層六孔板中；取培養(yǎng)好的SCs，消化后以2×105密度接種于事先安放于六

7、孔板上層的插入式培養(yǎng)皿Millicell-HA中，待上下兩層細(xì)胞在濾膜和培養(yǎng)板中貼壁伸展后，以10％FBS，2μmol／L L-Glutamine，10ng／ml EGF,1％Penicillin／Streptomycin的DMEM／F12為共培養(yǎng)液，37℃，5％CO2,和95％濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；設(shè)立上層不接種SCs的插入式培養(yǎng)皿Millicell-HA為對(duì)照組；②取培養(yǎng)好的SCs消化后以2×105密度接種于事先經(jīng)多聚賴氨酸包被的六孔

8、板中，取P10代BMSCs消化后以1×105密度接種于事先安放于六孔板上層的插入式培養(yǎng)皿Millicell-HA中，待上下兩層細(xì)胞在濾膜和培養(yǎng)板中貼壁伸展后，以10％FBS，2μmol／L L-Glutamine，10 ng／ml EGF,1％Penicillin／Streptomycin的DMEM／F12為共培養(yǎng)液，37℃，5％CO2,和95％濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；設(shè)立不接種BMSCs的插入式培養(yǎng)皿Millieell-HA為對(duì)照組。該實(shí)

9、驗(yàn)中，方法①用于觀察SCs對(duì)BMSCs的生物誘導(dǎo)作用和BMSCs的分化能力；方法②用于觀察BMSCs對(duì)SCs增殖能力的影響。 4.檢測(cè)SCs增殖能力和BMSCs分化能力的方法：利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs表面抗原CD29、CD44、CD45。共培養(yǎng)4天后，應(yīng)用RT-PCR，Western blot和免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)SCs標(biāo)記物S-100蛋白和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP的表達(dá)水平，評(píng)估共培養(yǎng)后BMSCs的分化能力和SCs的增殖

10、能力。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以Mean±SD表示。采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以不接種SCs的插入式培養(yǎng)皿Millicell-HA為對(duì)照組，比較共培養(yǎng)體系中BMSCs分化情況；以不接種BMSCs的插入式培養(yǎng)皿Millicell-HA為對(duì)照組，比較共培養(yǎng)體系中SCs增殖情況。組間比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有顯著性。 結(jié)果 1.本實(shí)驗(yàn)使用膠原酶／中性蛋白酶雙酶消化法，SCs培養(yǎng)中加入fors

11、kolin和BPE，培養(yǎng)原代SCs細(xì)胞，3-5天即可達(dá)80％-90％融合，S-100陽性細(xì)胞呈棕黃色，胞體小，有細(xì)長(zhǎng)的兩個(gè)突起或少數(shù)的三個(gè)突起，胞體輪廓清晰呈梭形或三角形。而扁平不規(guī)則的成纖維細(xì)胞呈S-100陰性反應(yīng)。原代培養(yǎng)的SCs細(xì)胞達(dá)90％融合時(shí)，S-100的陽性率為70％±2.1％。 2.成年BMSCs原代培養(yǎng)至6-7天時(shí)，細(xì)胞融合成單層。原代細(xì)胞形態(tài)不均一，由小圓形、梭形、寬大的扁平狀細(xì)胞構(gòu)成。待細(xì)胞達(dá)80％-90％融

12、合時(shí)連續(xù)傳代，P4代以后，梭形細(xì)胞逐漸增多。流式細(xì)胞儀分析顯示，本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的P10代BMSCs抗原表達(dá)具有較高的均一性，標(biāo)記間質(zhì)細(xì)胞的CD29和CD44強(qiáng)陽性表達(dá)，而標(biāo)記造血干細(xì)胞的CD45為陰性。 3.成年SCs誘導(dǎo)組BMSCs與空細(xì)胞對(duì)照組相比大部分形態(tài)沒有改變，但體積縮小，少數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)多個(gè)突起的神經(jīng)元樣或兩個(gè)或三個(gè)突起的類許旺細(xì)胞樣。免疫熒光顯示：誘導(dǎo)組BMSCs表達(dá)GFAP的陽性率為92.73％±3.347％，對(duì)照組僅為

13、5.68％±5.06％；誘導(dǎo)組BMSCs表達(dá)S-100的陽性率為83.7％±7.797％；而對(duì)照組BMSCs僅為3.86％±0.99％。RT-PCR和western blot檢測(cè)出誘導(dǎo)組BMSCs不僅表達(dá)GFAP mRNA也表達(dá)GFAP蛋白，而空細(xì)胞對(duì)照組BMSCs則檢測(cè)不到GFAP mRNA和GFAP蛋白的表達(dá)。 4.與成年BMSCs共培養(yǎng)的成年SCs形態(tài)同空細(xì)胞對(duì)照組，與BMSCs共培養(yǎng)組SCs細(xì)胞S-100的陽性率達(dá)68.

14、76％±9.218％，顯著高于空細(xì)胞對(duì)照組SCs細(xì)胞S-100陽性率42.03％±4.655％。 結(jié)論 1.使用膠原酶／中性蛋白酶雙酶并聯(lián)合使用forskolin和BPE兩種促分裂劑培養(yǎng)成年SCs，能在短時(shí)間內(nèi)最大程度地獲得大量高純度的成年大鼠原代SCs。 2.使用全骨髓貼壁法，能夠在P10代時(shí)得到純度較高的BMSCs，此法優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便易行。 3.成年大鼠P10代BMSCs與原代SCs在Millicell-