棉花腺體形成時期相關(guān)基因的克隆與分析.pdf

1、植物次生代謝物質(zhì)的有無及含量與其貯藏器官－腺體（或腺毛）的有無及多少密切相關(guān)。了解次生代謝物質(zhì)貯藏器官發(fā)生與形成的基因網(wǎng)絡(luò)及及其調(diào)控機制，能為實踐中有效的調(diào)控植物次生代謝提供理論依據(jù)。其中，棉屬植物的棉酚與其貯藏器官腺體（gland）是研究次生代謝工程較理想的一個研究模式。
　　棉酚（Gossypol）為錦葵科棉族(Gossypieae)植物特有，存在于色素腺體（pigment gland）中，是棉花自身重要的抗性物質(zhì)，但由于棉酚

2、對人類和單胃動物有毒，限制了豐富的棉籽蛋白及油脂資源的利用。為有效調(diào)控棉酚合成，極有必要對色素腺體形成的分子機制進行研究。
　　本論文的研究首先以“湘棉18”特殊腺體為材料（種子無腺體，植株有腺體，種子萌發(fā)過程中腺體逐漸增多。），構(gòu)建了其腺體形成時期的均一化全長 cDNA文庫。其次，選用湘棉18，川2082（種子、植株都有腺體），無腺體棉－顯無N5（種子、植株都無腺體）為材料，利用不同的材料腺體差別，通過棉花基因芯片，對腺體形成時

3、期的基因進行高通量篩選，篩選到的明顯表達變化的基因后，在所建 cDNA文庫中進行克隆，篩選到相關(guān)基因后，結(jié)合生物信息學(xué)方法對所克隆的基因進行功能預(yù)測，并對其展開了不同部位的時空表達研究，從而為揭示棉花腺體形成提供了重要的分子機制理論依據(jù)。
　　實驗研究結(jié)果如下：
　　1.湘棉18腺體形成時期均一化全長cDNA文庫構(gòu)建：
　　構(gòu)建了湘棉18腺體形成時期的均一化全長 cDNA文庫，主要采用SMART（Switching m

4、echanism at5 end of RNA transcript）技術(shù)與DSN技術(shù)(Duplex-specific nuclease)相結(jié)合的方法，即 mRNA逆轉(zhuǎn)錄后合成cDNA，經(jīng)均一化處理后，Sfi I酶切，連接在質(zhì)粒載體，電轉(zhuǎn)化，最后獲得5.86×105個獨立克隆，重組率高達94％，插入片段的平均長度約為1.4 kb，從而成功建立棉花腺體形成相關(guān)基因的cDNA文庫。通過均一化文庫的建立，使文庫中高豐度基因拷貝數(shù)有了很大程度的

5、降低，而低豐度基因的豐度得到相對提升，從而大大增加了從文庫中克隆發(fā)現(xiàn)新基因的概率。
　　2．棉花腺體發(fā)育過程中的基因表達變化的高通量分析
　　為了對棉花腺體形成提供更多信息，本研究利用高通量的方法分析了棉花腺體形成過程中的基因表達變化。采用包含大約23,977個基因探針的Affymetrix棉花基因芯片，以湘棉18突變體、野生棉（川2802）、無腺體棉（顯無N5）為研究材料，對腺體形成過程中差異表達的基因進行了鑒定。結(jié)果顯示

6、，在腺體形成過程中，湘棉18腺體形成時、湘棉18腺體形成前、無腺體棉N5三種材料中的共同有差異表達的基因311條，其中112條上調(diào)，191條下調(diào)；川（2802）、湘棉18腺體形成前、無腺體棉N5的共同差異表達的基因有549條，其中218條上調(diào)，331條下調(diào)。上述基因主要涉及蛋白質(zhì)聚合、微管運動、脂類合成、氨基酸磷酸化、代謝途徑調(diào)控的酶基因、受外界脅迫表達的抗逆相關(guān)基因、光合作用相關(guān)基因、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子等以及其它一些未知功能的基因。接著采用

7、RT-PCR驗證了其中6個基因，均與芯片結(jié)果一致。從中可以推測，腺體的形成是多因素多基因共同作用的結(jié)果，它們通過相互調(diào)節(jié)并形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而直接或間接地導(dǎo)致腺體的形成。
　　3．棉花腺體形成相關(guān)的基因GRP1的克隆和分析
　　從基因芯片篩選的與腺體形成相關(guān)的基因中，選取 DW513956設(shè)計引物，對均一化全長文庫進行PCR篩選，獲得全長序列，命名為GRP1（GeneBank收錄號：EU3703012）。GRP1基因全長為12

8、03 bp的cDNA序列，開放閱讀框起始位點為25bp處，終止位點為771bp處，編碼248個氨基酸。蛋白分子量為33.09 KD，理論等電點pI為8.99，亞細(xì)胞定位在胞質(zhì)內(nèi)，GRP1屬于疏水分泌性蛋白質(zhì)，有一個信號肽，具分泌型過氧化物酶的保守區(qū)域。與煙草的過氧化物酶，紅豆的過氧化物酶，大戟等的相似度較高，分別為75%，75%，73%。
　　對GRP1基因，進一步應(yīng)用原位雜交的方法分析其表達的具體部位，從分子水平研究腺體形成的機

9、理，發(fā)現(xiàn)其mRNA的表達主要集中在植株的纖維化程度高的部位，如導(dǎo)管、厚壁細(xì)胞等位置，在薄壁細(xì)胞處表達量少。
　　4.腺體形成相關(guān)的基因GRP2的克隆和分析和的進一步分析
　　從基因芯片篩選的與腺體形成相關(guān)的基因中，選取 DT463838進行了深入分析。首先對均一化全長文庫進行PCR篩選，獲得全長序列，命名GRP2（GeneBank收錄號：EU3703033）。GRP2基因全長為1989 bp的cDNA序列，起始位點為135b