體外發(fā)散式?jīng)_擊波物理特性研究及對(duì)軟骨細(xì)胞和軟骨前體細(xì)胞生物學(xué)特性影響的初步研究.pdf

1、【研究背景】隨著全民健身運(yùn)動(dòng)的推廣普及,運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)損傷正呈現(xiàn)逐年增加的趨勢(shì),其中關(guān)節(jié)軟骨損傷的發(fā)生率很高,對(duì)2479例膝關(guān)節(jié)手術(shù)患者流行病學(xué)分布統(tǒng)計(jì)[1],其中關(guān)節(jié)軟骨損傷者占55.1％,年齡分布范圍大,中青年為主要人群,性別構(gòu)成比相近。關(guān)節(jié)軟骨損傷,常導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛、活動(dòng)障礙,嚴(yán)重者可喪失關(guān)節(jié)功能,成為肢體殘障的重要原因[2-4]。目前臨床上常用且較有效治療軟骨損傷的方法是關(guān)節(jié)鏡下微骨折術(shù),通過(guò)刺激骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)生成來(lái)修復(fù)

2、軟骨,且修復(fù)結(jié)果多為纖維組織,其抗壓能力較正常軟骨差;組織工程方法治療費(fèi)用昂貴、周期長(zhǎng),難以廣泛應(yīng)用,因此,軟骨修復(fù)目前仍是臨床最棘手的難題。我們前期研究中將微骨折術(shù)結(jié)合關(guān)節(jié)腔內(nèi)沖擊波修復(fù)兔股骨遠(yuǎn)端軟骨缺損,結(jié)果顯示有類(lèi)透明軟骨形成,明顯優(yōu)于單純微骨折術(shù)[5]。但對(duì)沖擊波修復(fù)軟骨損傷的機(jī)理尚不清楚。實(shí)驗(yàn)室研究表明, rESWT對(duì)軟骨損傷有修復(fù)作用[6]。臨床研究表明,rESWT對(duì)肱骨外上髁炎、岡上肌鈣化、跟腱炎、軟組織損傷、慢性疼痛的緩

3、解等具有肯定效果[7]。rESWT的臨床應(yīng)用過(guò)程中,存在影響指標(biāo)多而雜,缺乏一個(gè)統(tǒng)一的指標(biāo)來(lái)衡量和評(píng)價(jià)其作用效果。在臨床應(yīng)用過(guò)程中,會(huì)面對(duì)很多不同的疾病,具體使用何種沖擊波探頭、多大的壓力和頻率進(jìn)行對(duì)癥治療才能達(dá)到最佳效果,國(guó)內(nèi)外一直都沒(méi)有相關(guān)研究來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題[8]。
　　【研究目的】探索衡量rESWT作用效果的統(tǒng)一指標(biāo),初步研究rESWT刺激軟骨細(xì)胞和軟骨前體細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng),為進(jìn)一步探索rESWT修復(fù)軟骨損傷的最佳方法提供實(shí)

4、驗(yàn)依據(jù)。
　　【材料與方法】采用發(fā)散式?jīng)_擊波儀器測(cè)試直徑為15mm和6mm兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)探頭,觀(guān)察兩個(gè)探頭在不同壓力、頻率變化時(shí)的輸出能量(EFD)的變化規(guī)律。使用紋影成像系統(tǒng),觀(guān)察36mm平面狀沖擊頭、15mm標(biāo)準(zhǔn)治療頭、10mm標(biāo)準(zhǔn)治療頭、15mm長(zhǎng)形治療探頭,在壓力為2×105 Pa,3×105 Pa,4×105 Pa,頻率為10Hz時(shí),使用高速數(shù)據(jù)采集儀觀(guān)察發(fā)散式?jīng)_擊波儀器輸出波形。觀(guān)察rESWT不同的探頭在不同工作壓力時(shí),在空

5、氣中沖擊波的傳播形態(tài)和作用距離。
　　我們使用新西蘭大白兔膝關(guān)節(jié)軟骨分離培養(yǎng)出軟骨細(xì)胞和軟骨前體細(xì)胞,經(jīng)過(guò)培養(yǎng)傳代至P2代,使用rESWT對(duì)其進(jìn)行刺激,壓力分組0.8×105 Pa,1.5×105 Pa,2.5×105 Pa,3.5×105 Pa,頻率10Hz,沖擊600次。觀(guān)察兩種細(xì)胞在rESWT刺激后24h時(shí)增殖情況差異,使用增殖活性最高的實(shí)驗(yàn)分組的壓力刺激進(jìn)行下步實(shí)驗(yàn)。組化染色觀(guān)察 rESWT刺激細(xì)胞后三系分化情況, Q-P

6、CR測(cè)試兩種細(xì)胞在rESWT刺激后的細(xì)胞內(nèi)軟骨分化相關(guān)mRNA水平的變化。
　　【結(jié)果】在測(cè)量rESWT輸出能量時(shí)發(fā)現(xiàn),相同的頻率時(shí),不同壓力對(duì)輸出能量的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。使用相同的壓力下,不同頻率對(duì)輸出能量的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。較小壓力時(shí)(0.5×105 Pa、1.0×105 Pa)隨著頻率的增加,單個(gè)脈沖的能量隨著上升;壓力逐漸增加時(shí)(2.0×105 Pa、3.5×105 Pa)隨著頻率的增加單

7、個(gè)脈沖的能量是逐漸下降的。隨著壓力的增加,每個(gè)頻率的單個(gè)脈沖的能量都是增加的,頻率越高時(shí)其增加的幅度變小。隨著工作壓力的增加,同一沖擊波探頭的作用距離也隨著增加?？諝庵袥_擊波作用距離從遠(yuǎn)到近依次為,36mm平面狀探頭>15mm長(zhǎng)形治療探頭>10mm標(biāo)準(zhǔn)治療頭>15mm標(biāo)準(zhǔn)治療頭。15mm長(zhǎng)探頭與15mm標(biāo)準(zhǔn)探頭相比,具有更遠(yuǎn)的作用距離和更大角度的作用范圍。
　　rESWT刺激軟骨細(xì)胞和軟骨前體細(xì)胞后24h,CCK-8法測(cè)試細(xì)胞增殖

8、活性,結(jié)果表明刺激后兩種細(xì)胞的增殖活性均增加(P<0.05),軟骨前體細(xì)胞比軟骨細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖活性(P<0.05)。組化染色結(jié)果可以看到,軟骨細(xì)胞分化能力不明顯,軟骨前體細(xì)胞在沖擊波刺激和誘導(dǎo)之后,具有較強(qiáng)的分化能力。Q-PCR測(cè)試細(xì)胞內(nèi)軟骨相關(guān) mRNA表達(dá)情況的結(jié)果顯示,無(wú)論是否進(jìn)行軟骨分化誘導(dǎo),1.5×105 Pa組的rESWT刺激均能上調(diào)軟骨分化相關(guān)基因的表達(dá)水平(P<0.05),且軟骨前體細(xì)胞比軟骨細(xì)胞表達(dá)相關(guān)基因水平更高