化妝品安全性評(píng)價(jià)中皮膚毒性若干替代實(shí)驗(yàn)方法的研究.pdf

1、本文擬在借鑒歐盟研究成果的基礎(chǔ)上，對(duì)化妝品安全性評(píng)價(jià)中若干皮膚毒性的替代實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行研究。目的是為國(guó)內(nèi)開展相關(guān)方法學(xué)研究和制定我國(guó)化妝品安全性評(píng)價(jià)替代實(shí)驗(yàn)方法的技術(shù)指南提供依據(jù)。 一、小鼠局部淋巴結(jié)試驗(yàn)(LLNA)方法的改進(jìn)研究 目的：改進(jìn)小鼠局部淋巴結(jié)試驗(yàn)(LLNA)，建立既可檢測(cè)化學(xué)物的致敏性也可同時(shí)檢測(cè)刺激性的LLNA替代方法。方法：選取一種陰性物質(zhì)：4-氨苯甲酸；三種致敏陽(yáng)性物：2，4-二硝基氯苯(DNCB)、己

2、基肉桂醛(HCA)和2-氨基酚(2-APC)；以及兩種刺激陽(yáng)性物：氫氧化鉀(KOH)、十二烷基硫酸鈉(SDS)。按常規(guī)LLNA方法對(duì)雌性Balb/c小鼠進(jìn)行染毒，測(cè)量小鼠耳緣厚度，于第6天仁慈處死小鼠稱量耳廓重量，獲取耳引流淋巴結(jié)進(jìn)行稱重，制備單細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)并用cck-8試劑盒檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖活性。結(jié)果：受試劑量氫氧化鉀、十二烷基硫酸鈉和2，4-二硝基氯苯在0.5％以上劑量，可引起耳緣厚度和耳廓重量增加，與對(duì)照組相比差異有顯著性(p＜0

3、.05)，可能判定為對(duì)皮膚有刺激性；2-氨基酚和己基肉桂醛均無(wú)刺激性。三種致敏物在致敏試驗(yàn)中均呈陽(yáng)性，但不同檢測(cè)指標(biāo)敏感性有差異。己基肉桂醛，2，4-二硝基氯苯，2-氨基酚均可引起淋巴結(jié)重量增加，差異有顯著性(p＜0.05)；三者均可引起淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)增加，但己基肉桂醛僅在最高劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；己基肉桂醛和2，4-二硝基氯苯在中劑量以上組和高劑量十二烷基硫酸鈉均可致cck-8檢測(cè)的淋巴細(xì)胞增殖明顯增加，氫氧化鉀在致敏性指標(biāo)中均為陰性。結(jié)

4、論：以耳緣厚度和耳廓重量作為刺激性觀察指標(biāo)，以淋巴結(jié)重量和淋巴細(xì)胞增殖作為致敏性觀察指標(biāo)的改良小鼠淋巴結(jié)試驗(yàn)可有效地同時(shí)評(píng)價(jià)化學(xué)物的皮膚致敏性和刺激性，有發(fā)展成為一種替代方法的潛力。 二、皮膚刺激性EpidermTM模型實(shí)驗(yàn)方法的建立 目的：通過(guò)構(gòu)建重組人EpiDerm皮膚模型，建立檢測(cè)化妝品的皮膚腐蝕性/刺激性的替代實(shí)驗(yàn)方法。方法：取人的包皮組織，分離表皮和真皮后分別進(jìn)行原代培養(yǎng)，用鼠尾膠原構(gòu)建皮膚模型，經(jīng)氣液面培養(yǎng)后

5、，腐蝕性試驗(yàn)作用3min和1h，刺激性試驗(yàn)作用15min后續(xù)培養(yǎng)42h，檢測(cè)化學(xué)物致皮膚模型細(xì)胞活性的改變(MTT試驗(yàn))和IL-1α的釋放量(ELISA法)，評(píng)價(jià)化學(xué)物的腐蝕性/刺激性。結(jié)果：腐蝕性試驗(yàn)中，MTT檢測(cè)作用于3種腐蝕性化學(xué)物(正辛酸、10％KOH、丙烯酸)后，細(xì)胞相對(duì)活性均＜50％(3min)和＜15％(1h)；而2種非腐蝕性化學(xué)物(四氯乙烯、丁香酚)使細(xì)胞相對(duì)活性變化不大。刺激性試驗(yàn)中，MTT檢測(cè)4種刺激性化學(xué)物細(xì)胞相對(duì)

6、活性，其中3種化學(xué)物(三氯乙烷、5％KOH、10％SDS)致細(xì)胞活性明顯小于50％，2種非刺激性化學(xué)物(乙醇、丙二醇)和1％TritonX-100作用后細(xì)胞活性＞50％，在ELISA試驗(yàn)中，僅TritonX-100致IL-1α釋放量大于60pg/ml，說(shuō)明其同樣具有刺激性。結(jié)論：所建人重組皮膚模型實(shí)驗(yàn)方法基本成功，可以做為檢測(cè)化學(xué)物皮膚腐蝕性/刺激性的體外替代方法。 三、THP-1細(xì)胞體外致敏性試驗(yàn)方法的研究 目的：探討

7、建立以THP-1為受試細(xì)胞，以細(xì)胞表面標(biāo)志物CD54和CD86的抗體表達(dá)改變?yōu)闄z測(cè)指標(biāo)的體外致敏性試驗(yàn)方法。方法：采用人單核細(xì)胞系白血病淋巴瘤細(xì)胞THP-1，經(jīng)過(guò)細(xì)胞因子GM-CSF、IL-4誘導(dǎo)分化成未成熟樹突狀細(xì)胞后，分別對(duì)未誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞和誘導(dǎo)后細(xì)胞給予受試物，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物CD54和CD86的抗體表達(dá)改變，評(píng)價(jià)化學(xué)物對(duì)皮膚的致敏性。結(jié)果：致敏物DNCB、HCA、EN作用于THP-1細(xì)胞后，DNCB和EN能使C

8、D54和CD86的抗體熒光表達(dá)增強(qiáng)，與對(duì)照相比大于140％，但HCA致熒光增強(qiáng)不明顯。受試物作用經(jīng)誘導(dǎo)后的未成熟樹突狀細(xì)胞，表面抗體的熒光表達(dá)量都未見明顯增高。結(jié)論：采用THP-1細(xì)胞檢測(cè)CD54和CD86的抗體表達(dá)的試驗(yàn)方法，可檢測(cè)中高致敏性化學(xué)物，但不適合弱致敏性化學(xué)物的評(píng)價(jià)。 四、利用人皮膚組織模型研究納米TiO2的經(jīng)皮吸收和致突變性 目的：探討納米TiO2能否穿透皮膚組織并產(chǎn)生基因突變作用。方法：構(gòu)建人重組皮膚模

9、型后培養(yǎng)于Tanswell小室上方，下層培養(yǎng)L5178Y細(xì)胞，將納米TiO2作用于皮膚模型上，采用微孔板Tk基因突變的試驗(yàn)方法檢測(cè)下層L5178Y細(xì)胞是否發(fā)生基因突變。結(jié)果：隨著受試納米TiO2濃度的增加，直接接觸和間接接觸細(xì)胞的相對(duì)懸浮生長(zhǎng)率均呈下降趨勢(shì)，但間接接觸的細(xì)胞相對(duì)懸浮生長(zhǎng)率普遍大于直接接觸者。隨著劑量的增加，平板效率和相對(duì)存活率也呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但各組間TFT突變率卻無(wú)明顯差別。結(jié)論：納米TiO2能穿透人皮膚組織模型，但皮膚