丁酸鈉誘發(fā)腸易激綜合征結(jié)腸高敏性的發(fā)生機(jī)制研究.pdf

1、腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)是臨床上最常見的胃腸道疾病，以腹部不適或腹痛伴排便異常為主要特征，缺乏形態(tài)學(xué)和生化指標(biāo)的異常。IBS患者普遍伴有結(jié)腸敏感性的增高，這表明感覺神經(jīng)參與了本病的發(fā)生，其興奮性的增加在感知疼痛或反射控制方面起了重要作用。研究發(fā)現(xiàn)IBS患者的結(jié)腸高敏性的產(chǎn)生主要是由于胞體位于背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)的內(nèi)臟傳入纖維致敏所致，但其參與機(jī)制尚

2、未明確。 深入研究IBS結(jié)腸高敏感性的發(fā)病機(jī)制，繼而開發(fā)新的治療方法，必須以合適的動物模型為基礎(chǔ)。最新的報道表明，丁酸鈉灌腸可以成功制作具備。IBS患者結(jié)腸高敏性的動物模型，而IBS患者結(jié)腸內(nèi)丁酸鹽含量上升的發(fā)現(xiàn)使得該模型更具相關(guān)性。 基于以上研究背景，本研究通過建立體外胎鼠DRG神經(jīng)元丁酸鈉培養(yǎng)模型，研究單因素丁酸鈉對體外培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元SP、CGRP合成與釋放及VRl活性的影響作用，探討其可能的機(jī)制；并用丁酸鈉灌腸

3、制作具備IBS患者結(jié)腸高敏性的大鼠動物模型，觀察模型大鼠DRG神經(jīng)元SP、CGRP和VRl的表達(dá)變化，并就其在IBS發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制進(jìn)行探討，為：IBS尋求新的治療靶點提供實驗依據(jù)。全文分為二部分： 第一部分：丁酸鈉對辣椒素誘發(fā)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元感覺神經(jīng)肽釋放的調(diào)節(jié)作用 將胎齡為15 d的Wistar大鼠DRG神經(jīng)元在體外分散培養(yǎng)24 h，然后分為5組：其中一組神經(jīng)元不施加任何干預(yù)因素，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，作為正常對照組

4、；其余4組神經(jīng)元均在培養(yǎng)液中加入丁酸鈉，使其終濃度分別為0.01 mmol/L，0.1lmmol/L，1 mmol/L，10 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)48 h；用作放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)的標(biāo)本再增加一個辣椒素溶劑對照組。終止培養(yǎng)后，用RT-PCR法和Western Blot法對各組標(biāo)本都進(jìn)行SP、CGRP、VR1 mRNA和VRl蛋白的測定；用RIA法測定各組神經(jīng)元SP和CGRP的基礎(chǔ)釋放量；隨后在各組培

5、養(yǎng)液中加入辣椒素(300 nmol/L)孵育5 min，用RIA法測定各組神經(jīng)元SP和CGRP的辣椒素誘發(fā)釋放量。根據(jù)以上各項檢測結(jié)果綜合分析丁酸鈉對DRG神經(jīng)元的影響作用及其機(jī)制。 實驗結(jié)果如下： (1)高濃度丁酸鈉(1 mmol/L，10 mmol/L)促進(jìn)原代分散培養(yǎng)的胎鼠DRG神經(jīng)元SP和CGRP mRNA的表達(dá)，與對照組和低濃度丁酸鈉(0.01 mmol/L0.1 mmol/L)組相比較，均具有顯著性差異(P<

6、0.001)；低濃度丁酸鈉組與對照組相比較，在統(tǒng)計學(xué)上沒有顯著性差異。 (2)不同濃度的丁酸鈉都可促進(jìn)原代分散培養(yǎng)的胎鼠DRG神經(jīng)元VR1mRNA和蛋白的表達(dá)，與對照組相比較，均具有顯著性差異(P<0.05)，并呈劑量相關(guān)性。 (3)丁酸鈉不能改變原代分散培養(yǎng)的胎鼠DRG神經(jīng)元SP和CGRP的基礎(chǔ)釋放量，與對照組相比較，在統(tǒng)計學(xué)上沒有顯著性差異；高濃度丁酸鈉(1mmol/L，10 mmol/L)可提高辣椒素刺激原代分散培

7、養(yǎng)胎鼠DRG神經(jīng)元的SP和CGRP釋放量，與對照組、辣椒素溶劑對照組和低濃度丁酸鈉(0.01 mmol/L，0.1 mmol/L)組相比較，均具有顯著性差異(P<0.05)；低濃度丁酸鈉對辣椒素刺激原代分散培養(yǎng)胎鼠DRG神經(jīng)元的SP和CGRP釋放量則沒有影響，與對照組相比較，在統(tǒng)計學(xué)上沒有顯著性差異。 以上結(jié)果表明：丁酸鈉本身對原代分散培養(yǎng)的胎鼠DRG神經(jīng)元沒有直接的興奮作用，不能直接誘發(fā)SP和CGRP的釋放，但丁酸鈉可劑量相關(guān)

8、性的誘發(fā)vRl mRNA及其蛋白表達(dá)增加，提高了DRG神經(jīng)元對辣椒素刺激的敏感性；同時高濃度的丁酸鈉可增加SP和CGRP mRNA的表達(dá)，增加了SP和CGRP的合成；以上兩點共同導(dǎo)致原代分散培養(yǎng)的胎鼠DRG神經(jīng)元在辣椒素孵育時SP和CGRP的釋放量增加，提高了DRG神經(jīng)元對辣椒素刺激的效應(yīng)性。 第二部分：感覺神經(jīng)肽和辣椒素受體在腸易激綜合征結(jié)腸高敏性發(fā)生中的作用 體重220～240g健康成年雄性Wistar大鼠80只，隨

9、機(jī)分為10組，每組8只，4只大鼠一籠，可隨意獲取食物和水，盡量減少或避免動物的不適。在所有的實驗操作前，將大鼠于實驗室環(huán)境中飼養(yǎng)7d。 取2組動物，將Fogarty導(dǎo)管插入大鼠肛門7cm，到達(dá)結(jié)腸，對照組和丁酸鈉組分別灌注1 ml生理鹽水或中性丁酸鈉溶液(200 mmol/L)，2次/d，共灌注3d。在第1次灌腸后的第9 d對結(jié)直腸球囊擴(kuò)張實驗(colorectal distention，CRD)時壓力誘導(dǎo)的行為學(xué)反應(yīng)進(jìn)行評價，

10、記錄CRD閾值，并對結(jié)腸粘膜行肉眼觀察和結(jié)腸髓過氧物酶(myeloperoxidase，MPO)活性測定；同時分別采集2組Wistar大鼠血標(biāo)本和L<,6>～S<,2>胸腰段DRG，用RIA法測定血漿SP和CGRP的含量；并用RT-PCR技術(shù)和Western Blot技術(shù)分別檢測大鼠DRG中SP、CGRP及VRl的mRNA和各自蛋白的表達(dá)。 在實驗中，另外8組動物應(yīng)用外源性SP、CGRP、L733060(NK1受體抑制劑)、CG

11、RP8-37(CGRP受體抑制劑)或辣椒素后，觀察動物CRD閾值的變化，進(jìn)而評價感覺神經(jīng)肽SP、CGRP和VR1途徑在丁酸鈉灌腸建立IBS模型中的作用，為探索IBS新的、有效的治療靶點提供實驗依據(jù)。 實驗分為10組：(1)對照組；(2)丁酸鈉組；(3)L733060預(yù)處理組：每次丁酸鈉灌腸前10 min，靜脈注射L733060(3 mg/kg)；(4)CGRP8-37預(yù)處理組：每次丁酸鈉灌腸前10 min，靜脈注射CGRP8-3

12、7(20 ug/kg)；(5)辣椒素預(yù)處理組：丁酸鈉灌腸4 d前皮下注射辣椒素(50 mg/kg)；(6)SP組：靜脈注射4mg/kg的SP，10 min后測定疼痛閾值； (7)CGRP組：靜脈注射500 ng/kg的CGRP，10 min后測定疼痛閾值；(8)L733060治療組：第1次灌腸后第9 d，在CRD前10 min靜脈注射L733060(3 mg/kg)；(9)CGRP8-37治療組：第1次灌腸后第9 d，在CRD前10 m

13、in靜脈注射CGRP8-37(20 ug/kg)；(10)辣椒素治療組：第1次丁酸鈉灌腸后第5 d，皮下注射50 mg/kg辣椒素。除了SP組和CGRP組，其它各組觀察的時間點為第1次灌腸后的第9 d。 實驗結(jié)果如下： (1)丁酸鈉灌腸能誘導(dǎo)大鼠DRG中VRl蛋白和SP、CGRP、VRl。mRNA的表達(dá)，增加血漿SP和CGRP的濃度，但模型大鼠DRG中SP和CGRP的含量顯著降低。 (2)正常大鼠靜脈注射SP或C

14、GRP可造成大鼠結(jié)腸CRD閾值下降，敏感性增強(qiáng)。 (3)丁酸鈉灌腸建立IBS結(jié)腸高敏性動物模型的作用可被預(yù)先給予L733060、CGRP8-37或辣椒素完全取消。 (4)靜脈注射CGRP8-37或皮下注射辣椒素，可逆轉(zhuǎn)丁酸鈉灌腸所引起的IBS結(jié)腸高敏性模型大鼠的結(jié)腸感覺過敏，增加模型動物的CRD閾值，使其達(dá)到正常動物水平。 以上結(jié)果表明：丁酸鈉灌腸所引起的大鼠結(jié)腸感覺過敏，與SP和CGRP的釋放增加密切相關(guān)，而S