一種新型升血小板基因工程產(chǎn)品制備工藝優(yōu)化及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究.pdf

1、血小板減少癥在臨床治療中較為常見,嚴(yán)重的血小板水平低下直接威脅著人體生命安全。血小板減少性紫癜、腫瘤放/化療、再生障礙性貧血及骨髓移植等許多因素都能引起血小板減少。目前,臨床上應(yīng)對(duì)血小板減少的主要治療方法仍然是直接輸注血小板;然而,血小板輸注存在著輸血反應(yīng)、病原體感染等多種隱患。已知血小板由骨髓巨核細(xì)胞產(chǎn)生,因而通過對(duì)巨核細(xì)胞增殖分化進(jìn)行調(diào)控可以達(dá)到促進(jìn)血小板生成的目的。所以,能夠促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖分化的造血生長因子類基因工程藥物越來越受

2、到人們的廣泛關(guān)注。
　　血小板生成素(thrombopoietin, TPO),也稱為巨核細(xì)胞生長發(fā)育因子(megakaryocyte growth and development factor, MGDF),是調(diào)節(jié)巨核細(xì)胞增殖分化和血小板生成的重要細(xì)胞因子,可通過與受體(c-Mpl)的結(jié)合,激活巨核細(xì)胞中相應(yīng)的信號(hào)通路,發(fā)揮其促巨核細(xì)胞增殖分化的作用。人們利用基因重組方法,研制出聚乙二醇化的重組人巨核細(xì)胞生長發(fā)育因子(pegyl

3、ated recombinant human megakaryocyte growth and development factor, PEG-rhMGDF)和重組人血小板生成素(recombinant human thrombopoietin, rhTPO)兩種第一代促進(jìn)血小板生成基因工程藥物。但是,PEG-rhMGDF在美國進(jìn)行二期臨床試驗(yàn)時(shí),發(fā)現(xiàn)其能誘導(dǎo)產(chǎn)生與內(nèi)源性TPO起交叉反應(yīng)的中和性抗體,反而使患者血小板水平進(jìn)一步降低。因此

4、,美國FDA隨即全面禁止了重組人TPO基因工程藥物的臨床實(shí)驗(yàn)。之后,人們又用噬菌體表面展示技術(shù)篩選出一種由14個(gè)氨基酸組成的TPO模擬肽(thrombopoietin mimetic peptide, TMP),它與TPO無同源序列,但與 c-Mpl具有較高親和力。研究表明,TMP尤其是其二聯(lián)體(dTMP)不僅能促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖,并且不會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生 TPO中和性抗體。然而,由于 TMP分子量只有1.5KD,通過基因工程制備難度較大,并且在

5、體內(nèi)循環(huán)中極易被降解。
　　已有研究表明,人生長激素(human growth hormone, hGH)對(duì)骨髓造血干細(xì)胞的增殖和/或分化具有重要調(diào)控作用,并且發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)應(yīng)用后可加速血小板水平恢復(fù)。hGH可通過與其受體(growth hormone receptor, GHR)結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)活性,該受體與c-Mpl為同類細(xì)胞因子受體,可激活相似的信號(hào)通路。因此,本室將GH與dTMP進(jìn)行融合,構(gòu)建出重組融合蛋白分子 dTMP-GH,

6、以期發(fā)揮協(xié)同促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖及血小板生成作用。另一方面,融合蛋白dTMP-GH的分子量為26KD,較單純TMP更容易進(jìn)行基因工程制備,且可望延長其體內(nèi)半衰期。
　　前期工作中,我們已構(gòu)建并篩選出特異性表達(dá) dTMP-GH的工程菌株,并進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室水平的小規(guī)模制備。在此基礎(chǔ)上,為放大生產(chǎn),滿足新藥申報(bào)要求,本研究進(jìn)一步對(duì)融合蛋白 dTMP-GH在大腸桿菌中的高效表達(dá)和純化制備工藝進(jìn)行了優(yōu)化,最終實(shí)現(xiàn)了該重組融合蛋白的中試放大生產(chǎn),獲

7、得純度大于98％的目標(biāo)產(chǎn)品,并對(duì)該融合蛋白的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及體內(nèi)分布進(jìn)行了初步研究。主要研究結(jié)果與結(jié)論如下:
　　1.基于已有的dTMP-GH表達(dá)菌株,通過對(duì)培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化,成功將從一個(gè)單克隆到獲得目的蛋白菌體整個(gè)酵表達(dá)過程控制在30小時(shí)以內(nèi),含目的蛋白的濕菌產(chǎn)量達(dá)50g/L,目的蛋白表達(dá)量占總蛋白的25%,高壓勻漿破菌后dTMP-GH包涵體含量達(dá)到50%以上。
　　2.為提高效率和處理量,采用超濾法代替透析

8、法對(duì)包涵體進(jìn)行復(fù)性。通過對(duì)純化條件的優(yōu)化,目前單次純化所得融合蛋白 dTMP-GH的量達(dá)到克級(jí),產(chǎn)品純度大于>98%。
　　3.對(duì)融合蛋白dTMP-GH的分子量、等電點(diǎn)、氨基酸序列、純度等理化特性及其凍干制劑成品的水分、pH值、滲透壓摩爾濃度、蛋白含量、純度、質(zhì)譜分子量、質(zhì)量肽譜分析、宿主菌蛋白殘留、外源性 DNA殘留、細(xì)菌內(nèi)毒素含量、熱原、生物學(xué)活性等進(jìn)行了檢測,各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到治療用生物制品的申報(bào)標(biāo)準(zhǔn)要求。在此基礎(chǔ)上,與中國食品

9、藥品檢定研究院共同草擬了融合蛋白dTMP-GH的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案。
　　4.用放射性碘標(biāo)記融合蛋白 dTMP-GH,制備得到標(biāo)記率為71.5%、放射純度為96.5%、比活度為0.22MBq/μl的125I-dTMP-GH。BALB/c小鼠經(jīng)尾靜脈注射放射性125I標(biāo)記的dTMP-GH后,于30分鐘時(shí)股骨放射性計(jì)數(shù)達(dá)到最高值,占到注射總量的10%,隨時(shí)間推移經(jīng)肝、腎代謝排出體外。證實(shí)融合蛋白 dTMP-GH具有明顯骨髓偏向性分布特點(diǎn)。<