Bacillus atrophaeus B44產生iturin A及其對棉苗立枯病的防病促生作用.pdf

1、芽孢桿菌B44是從新疆棉花根際土壤中分離獲得，該菌對多種土傳植物病原菌均表現出很強的抑菌活性；在田間條件下，該菌對棉苗立枯病、棉花黃萎病以及加工番茄根腐病害表現出了較好的防治效果。為了進一步確定芽孢桿菌B44的種類及其防治棉苗立枯病的生防機理：本研究采用gyr A基因分析以及全基因組測序確定B44的分類地位，采用脂肽類抗生素特異性引物擴增以及RP-HPLC分析和 MALDI-TOF-MS鑒定確定了B44產生的脂肽類抗生素的種類；通過特異

2、性引物克隆到了與iturin A合成相關的ituC基因，并通過同源重組的方法敲除了該基因，明確了ituC基因對iturin A生物合成的重要影響，確定了iturin A是B44菌株防治棉苗立枯病的關鍵性的脂肽類抑菌活性物質；采用單因素和正交設計分析了不同碳源、氮源和無機鹽對B44菌株生物量和iturin A產量的影響，通過盆栽和小區(qū)試驗探討了B44菌株防治棉苗立枯病的生防機理。本研究主要內容包括：
　?、庞捎谖s芽孢桿菌和枯草芽孢

3、桿菌菌生長性狀的高度相似性往往引起二者的混淆，16S rRNA基因作為傳統(tǒng)的細菌分子鑒定法，但是它往往受限于親緣關系較近的芽孢桿菌變種間的分類，因而前期工作將該菌歸為枯草芽孢桿菌，并命名為Bacillus subtilis S44。本研究通過gyrA基因構建系統(tǒng)發(fā)育樹和全基因組序列與NCBI基因庫比對分析進一步確定該菌株的分類地位，確定Bacillus subtilisS44為萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus），并更

4、名為Bacillus atrophaeusB44。
　　⑵采用脂肽類抗生素特異性引物從B44菌株擴增到 mycosubtilin、fengycins、plipastatins、surfactins和iturin A五種脂肽類型。進一步通過MALDI-TOF-MS分析該菌株的脂肽粗提物，樣品中出現的m/z分別為1028.5、1058.8、1106.4、1121.4、1463.7、1477.7和1505.8。通過與報道的脂肽類抗生素m

5、/z比對和分析，結果表明B44菌株可產生C13-iturin A，C18-mycosubtilin，C15-surfactin，C16-fengycin A和C16-fengycin B和m/z為1106.4未知的脂肽類抗生素。
　?、菑腂44菌株中擴增出ituC基因片段，并將其克隆到pUC19質粒上，再通過tet基因插入到含有ituC基因片段的pUC19質粒上，將此重組質粒轉化到野生菌株中通過含有tet的培養(yǎng)基上篩選突變子。測定

6、ituC突變株和野生菌株iturin A的產生量以及對棉立枯病的的生物防效。結果表明：ituC突變株iturin A的產生量比野生菌株下降了75.9％，通過MALDI-TOF-MS分析，未檢測到iturin A，而fengycin和surfactin相對豐度值也顯著下降；對立枯病的盆栽防效表明，ituC突變株的平均生物防效為18.8%，比野生菌株的生物防效（47.6%）下降了60.5%。由此表明ituC對iturin A合成產生重要影響

7、，同時也表明iturin A是該菌株對棉立枯病發(fā)揮生物防效的關鍵性抑菌活性物質。
　?、韧ㄟ^iturin A的RP-HPLC定量分析和平板抑菌活性測定，分別以不加碳源、不加氮源和不加無機鹽的NA培養(yǎng)基為對照。結果表明：α-乳糖、果糖、玉米粉iturin A產生量顯著性較高，葡萄糖、麥芽糖、半乳糖和蔗糖iturin A的產生量較低，蔗糖的產生量最低，可溶性淀粉、d-木糖對iturin A產量增加影響不顯著；Iturin A產量較高的

8、氮源是KNO3，而NaNO3和豌豆粉對iturin A產量增加影響不顯著，其它氮源Ca(NO3)2、NH4NO3、酵母提取物、NH4Cl、(NH4)2SO4和尿素的iturin A產量均為下降，尿素的產生量為最低；MnSO4、CaCO3和CuSO4對iturin A產量有顯著的促進作用，MgSO4對iturin A產量增加無顯著性影響，而ZnSO4、KH2PO4、KCl和FeSO4對iturin A產量均具有抑制作用，ZnSO4產生的i

9、turin A產量最低。研究表明B44菌株抑菌活性與iturin A的產生量表現為顯著性或極顯著性相關。由正交實驗得到最高iturin A產量為204.3mg/L，其正交優(yōu)化組合包括玉米粉為10 g/L，豌豆粉5 g/L，果糖為10g/L，KNO3為10g/L，MnSO4為0.05g/L，MgSO4為1.0g/L。
　　⑸通過B44菌株不同營養(yǎng)發(fā)酵液對棉苗立枯病的盆栽和小區(qū)防效實驗，研究表明該菌株生物防效與iturin A產生量密

10、切相關。同時檢測到該菌株能夠產生赤霉素和嗜鐵素，且促生作用較強的發(fā)酵液可能與菌株產生較高濃度的赤霉素有關。通過單因素與正交優(yōu)化組合發(fā)酵液處理對棉立枯病的生物防效測定，正交優(yōu)化組合的盆栽防效達到72.8%，比單因素KNO3發(fā)酵液提高了10.2%，正交優(yōu)化組合的田間防效為62.6%，比單因素KNO3發(fā)酵液提高了9.1%。通過對棉苗SOD、POD和CAT誘導防御性酶酶活測定，發(fā)現相對防效較高的處理酶活活性顯著較高。由此表明該菌株生防機理還與促