表達兔出血癥病毒vp60基因的重組犬2型腺病毒的構建及其免疫效力評價.pdf

1、兔出血癥(Rabbit hemorrhagic disease，RHD)是由兔出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic diseasevirus，RHDV)引起成年兔的一種急性、致死性、接觸性傳染病，以呼吸系統(tǒng)出血和急性肝壞死為特征，是造成養(yǎng)兔業(yè)巨大損失的一種重要傳染病。本病于1984年首先在我國江蘇省爆發(fā)，隨即蔓延到世界各地。目前，免疫接種仍然是防治兔出血癥的主要措施。由于RHDV沒有適合培養(yǎng)的細胞系，現(xiàn)在商品化疫苗均為組織滅

2、活苗。雖然滅活苗安全有效，但存在著成本昂貴、生物安全和動物福利等諸多缺點。因此，探索研制安全、有效、成本低廉的新型兔出血癥疫苗具有現(xiàn)實意義。VP60蛋白是RHDV的主要結構蛋白和保護性抗原，在誘導抗病毒感染的免疫反應中發(fā)揮重要作用，是RHDV基因工程疫苗的首選蛋白。
　　犬2型腺病毒(Canine adenovirus type2，CAV2)是一種良好的病毒表達載體，具有易培養(yǎng)、重組病毒滴度高、外源蛋白表達量高等優(yōu)點，對兔不致病，

3、安全性好，可用于RHDV疫苗研發(fā)。本研究旨在構建表達RHDV vp60基因的E3區(qū)缺失的重組犬2型腺病毒rCAV2-VP60，并對其生長能力和遺傳穩(wěn)定性等生物學特性以及在兔體內的免疫效力進行評價，為研制RHDV新型病毒活載體疫苗奠定基礎。
　　本研究首先利用細菌內同源重組技術將CAV2 HLJ-10株的全基因組克隆到pShuttle-CMV載體上，構建了含有CAV2全基因組的骨架載體pCAV2。其次，采用融合PCR方法將E3區(qū)側翼

4、序列(23903-24933bp和26412-28055bp)和pcDNA3.1(+)的CMV表達盒序列(232-1252bp)融合在一起，并將其克隆到pUC18載體上，構建了E3區(qū)缺失的穿梭載體pUC-ΔE3-CMV。在此基礎上，將egfp基因定向克隆到穿梭載體pUC-ΔE3-CMV上，再利用穿梭載體和骨架載體共有的酶切位點NruⅠ和SalⅠ將含有edp基因的表達盒克隆到骨架載體pCAV2上得到了重組病毒質粒pCAV2-EGFP，用特

5、異性的內切酶AscⅠ酶切釋放出重組基因組，轉染MDCK細胞后獲得了重組病毒rCAV2-EGFP。經(jīng)鑒定該重組病毒能在MDCK細胞中穩(wěn)定表達EGFP，一步生長曲線與親本毒CAV2相似。這表明本研究利用pCAV2和pUC-ΔE3-CMV通過體外連接的方法構建重組犬2型腺病毒的策略是可行的，為下一步構建表達RHDVvp60基因的重組病毒rCAV2-VP60提供了技術平臺。
　　本研究利用PCR方法從質粒pcDNA-VP60中擴增出RHD

6、Vvp60基因，將其定向克隆到pUC-ΔE3-CMV中，再通過NruⅠ和SalⅠ特異性酶切位點將含有vp60基因的表達盒克隆到pCAV2中，獲得了重組質粒pCAV2-VP60，用AscⅠ酶切釋放出重組基因組后轉染MDCK細胞成功拯救出重組病毒rCAV2-VP60。PCR鑒定顯示vp60基因成功插入到rCAV2-VP60基因組中，將該重組病毒連續(xù)傳代20次，PCR鑒定顯示其具有良好的遺傳穩(wěn)定性;Western blot和IFA鑒定表明該重

7、組病毒能在MDCK細胞中表達VP60蛋白，表達的VP60蛋白具有良好的抗原性;一步生長曲線表明其生長特性與親本毒CAV2相似，病毒滴度最高可達107.5 TCID50/0.1mL。
　　將此重組病毒rCAV2-VP60以107 TCID50/1mL接種RHDV非免疫兔，兩周后加強免疫一次，同時與RHDV滅活苗和親本毒CAV2進行免疫效果比較，結果表明rCAV2-VP60組和RHDV滅活苗組在加強免疫后1周均檢測到RHDV特異性抗體

8、，并于加強免疫后3周達到高峰，之后開始下降，攻毒后抗體又迅速升高。rCAV2-VP60組免疫兔的T淋巴細胞增殖水平和細胞因子IFN-γ、IL-4含量均高于親本毒CAV2組。用致死劑量的RHDV HYD株滴鼻攻擊后，rCAV2-VP60組和RHDV滅活苗組所有家兔均未死亡，沒有出現(xiàn)典型的臨床癥狀和病理變化，而親本毒CAV2組所有家兔在攻毒后2天內全部死亡，臨床癥狀及病理變化都很明顯。
　　綜上所述，本研究成功構建了含有CAV2全基因