結(jié)球甘藍(lán)葉片卷曲關(guān)聯(lián)基因BoLH27和BoSF21的功能研究.pdf

1、植物葉片的卷曲發(fā)育可以改變?nèi)~片的平展性，進(jìn)而影響植物的呼吸作用和光合作用等重要生理過程。對結(jié)球甘藍(lán)(Brassica oleracea L.var.CapitataL)而言，葉片的自然卷曲發(fā)育是一種非常重要的農(nóng)藝性狀。結(jié)球甘藍(lán)是一種世界范圍內(nèi)廣泛種植的葉菜類蔬菜，在長期的演化過程中，幼葉、蓮座葉和球葉在形態(tài)上具有明顯的差異。幼葉和蓮座葉主要進(jìn)行平展擴(kuò)張生長，而球葉向上向內(nèi)卷曲抱合形成碩大的葉球。目前對植物葉片卷曲發(fā)育的研究多見于模式植物

2、擬南芥中，通過自然突變篩選獲得多個擬南芥葉片卷曲相關(guān)突變體，對其研究發(fā)現(xiàn)，bHLH類轉(zhuǎn)錄因子、TCP基因和生長素響應(yīng)因子等對這些突變?nèi)~片形態(tài)建成和發(fā)育均有重要的調(diào)控作用。而結(jié)球甘藍(lán)具有球葉自然卷曲的典型特性，為研究葉片卷曲提供了理想的材料。然而對甘藍(lán)葉片自然卷曲分子調(diào)控機(jī)制的研究還未見報道，因此了解甘藍(lán)球葉的自然卷曲發(fā)生的遺傳規(guī)律、揭露這一復(fù)雜調(diào)控過程中所參與的重要基因，可望為結(jié)球甘藍(lán)葉球發(fā)育分子機(jī)制的研究提供新內(nèi)容，進(jìn)而利用分子技術(shù)輔

3、助育種對現(xiàn)有品種品質(zhì)進(jìn)行遺傳改良。
　　為了探索和發(fā)掘參與結(jié)球甘藍(lán)葉片自然卷曲過程的重要調(diào)控基因，并分析其生物學(xué)功能，本論文以中熟結(jié)球性好甘藍(lán)519為材料，利用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)結(jié)合qRT-PCR技術(shù)篩選出可能參與葉片卷曲調(diào)控的基因BoLH27和BoSF21，克隆并對其序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，分別構(gòu)建了兩個基因的超量和抑制表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入甘藍(lán)，以期探究BoLH27和BoSF21基因在甘藍(lán)葉片卷曲過程中的功能。獲得主要研究結(jié)

4、果如下:
　　(1)結(jié)球甘藍(lán)不同發(fā)育時期莖尖與葉片的轉(zhuǎn)錄組對比分析與差異表達(dá)基因的篩選
　　依據(jù)結(jié)球甘藍(lán)自然生長狀態(tài)下葉片形態(tài)學(xué)上的差異性，我們提取結(jié)球甘藍(lán)蓮座期和結(jié)球期莖尖與葉片總RNA，送百邁克公司（北京）做轉(zhuǎn)錄組深度測序分析，用HiSeqTM2000測序完成后，利用Trinity軟件對各樣品數(shù)據(jù)分別進(jìn)行Unigenes組裝，共得到54209條Unigenes注釋信息。利用IDEG6軟件，發(fā)現(xiàn)其中蓮座期莖尖與葉片間表達(dá)存

5、在差異的基因有2923條，結(jié)球期莖尖與葉片間表達(dá)存在差異的基因有2307條;在蓮座期與結(jié)球期莖尖間表達(dá)存在差異的基因有652條，而在蓮座期與結(jié)球期的葉片間表達(dá)存在差異的基因卻有1786條，在上述兩時期莖尖和葉片間均差異表達(dá)的基因有488條。結(jié)合NT、NR、GO、COG、SwissProt、TrEMBL和KEGG等數(shù)據(jù)庫比對分析，通過比較基因log2(結(jié)球期葉片RPKM/蓮座期葉片RPKM)，依據(jù)在結(jié)球期葉片間表達(dá)差異顯著性由高到低的原則

6、結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索和基因功能注釋，從差異基因中發(fā)現(xiàn)其中含bHLH類轉(zhuǎn)錄因子有15個，生長素響應(yīng)因子有11個。
　　(2)基于轉(zhuǎn)錄組篩選差異基因的qRT-PCR表達(dá)分析
　　為了研究轉(zhuǎn)錄組所篩選差異基因的表達(dá)與甘藍(lán)葉片卷曲表型的關(guān)聯(lián)性，我們用Tips和Actin2基因作為內(nèi)參，通過熒光定量PCR技術(shù)分別對轉(zhuǎn)錄組篩選差異基因在不同時期不同類型葉片中的表達(dá)水平進(jìn)行了研究。依據(jù)相對表達(dá)水平差異顯著性，我們從中分別選取了一個差異表達(dá)最顯著

7、的bHLH轉(zhuǎn)錄因子和生長素響應(yīng)因子，分別命名為BoLH27和BoSF21基因。對BoLH27表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，在各時期莖尖中的表達(dá)差異趨勢不明顯，而在平展的蓮座葉中表達(dá)量相對較低，在卷曲程度更明顯的球葉中上調(diào)表達(dá)185.5倍。從蓮座期到結(jié)球期的生長變化過程中，甘藍(lán)BoLH27在葉片中的表達(dá)量在中間期就呈現(xiàn)出顯著上調(diào)表達(dá);此外，甘藍(lán)BoLH27在不同時期不同類型葉片中的總體表達(dá)變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組試驗(yàn)檢測其表達(dá)差異趨勢呈一致性。對BoSF21表達(dá)

8、水平分析發(fā)現(xiàn)，從蓮座期到結(jié)球期生長過程中，甘藍(lán)BoSF21在莖尖中的表達(dá)水平呈現(xiàn)先降低再升高的趨勢;BoSF21在各時期葉片中的表達(dá)表現(xiàn)出較大差異，其中在平展的蓮座葉中表現(xiàn)出相對較低的表達(dá)水平，在卷曲程度更明顯的球葉中表達(dá)量比蓮座葉上調(diào)65.33倍。同時，甘藍(lán)BoSF21在不同時期不同類型葉片中的總體表達(dá)變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組試驗(yàn)檢測其表達(dá)差異趨勢也完全吻合。由此，說明BoLH27和BoSF21兩個基因可能與甘藍(lán)葉片卷曲的調(diào)控有關(guān)。
　

9、　(3)甘藍(lán)BoLH27和BoSF21基因的克隆與生物信息學(xué)分析
　　依據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序所獲得的基因序列，結(jié)合十字花科和甘藍(lán)基因組數(shù)據(jù)庫，設(shè)計(jì)特異引物，通過同源克隆獲得了BoLH27和BoSF21的cDNA序列，其中BoLH27基因CDS全長為795 bp、編碼264個氨基酸;預(yù)測理論分子量為30387.05 Da，等電點(diǎn)為4.72;經(jīng)在線軟件對BoLH27編碼蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析表明該蛋白主要由27.65％的α-螺旋、12.88％的

10、β-折疊和59.47％的無規(guī)則卷曲構(gòu)成;通過Predictprotein和PROSITE和InterProScan在線預(yù)測結(jié)果顯示:在BoLH27第50～99位氨基酸處具有一個典型bHLH結(jié)構(gòu)域，符合完全保守的13E-16R以及Leu23對應(yīng)的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn);分子進(jìn)化分析表明BoLH27與擬南芥AtbHLH27氨基酸同源相似性最高，達(dá)81％，與AtTCP14親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。BoSF21基因CDS全長1035 bp、編碼344個氨基酸;預(yù)測

11、理論分子量為38082.48 Da，等電點(diǎn)為5.694;經(jīng)在線軟件對BoSF21編碼蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明該該蛋白主要由34.9％的α-螺旋、12.8％的β-折疊和52.3％的無規(guī)則卷曲構(gòu)成;通過在線軟件預(yù)測分析顯示BoSF21為跨膜蛋白，跨膜區(qū)域?yàn)?15-137氨基酸區(qū)段;分子進(jìn)化分析表明BoSF21與擬南芥BrSF21氨基酸同源相似性最高，達(dá)96％，與蓖麻和木棉親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
　　(4) BoLH27和 BoSF21的轉(zhuǎn)基因

12、功能驗(yàn)證
　　根據(jù)BoLH27和BoSF21基因的全長序列，分別設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物，通過與植物表達(dá)載體pCAMBIA1300多克隆位點(diǎn)連接，分別構(gòu)建了含BoLH27的正義表達(dá)載體pC35S-35S:senseBoLH27和反義表達(dá)載體pC35S-35S:antiBoLH27，以及含BoSF21正義表達(dá)載體pC35S-35S:senseBoSF21和反義表達(dá)載體pC35S-35S:antiBoSF21。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將上述表達(dá)

13、載體分別轉(zhuǎn)化甘藍(lán)下胚軸，經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)、侵染、暗培養(yǎng)、愈傷分化、不定芽增殖、生根、煉苗及移栽等過程獲得了轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)植株。通過提取轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示均有檢測到相應(yīng)大小的條帶，通過對轉(zhuǎn)基因植株中BoLH27和BoSF21定量表達(dá)分析也顯示，在BoLH27和BoSF21的正反義轉(zhuǎn)基因植株中均有檢測到不同水平的超量和抑制表達(dá)，初步說明BoLH27和BoSF21均成功整合到基因組DNA上。對轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)植株的表型初步觀察發(fā)現(xiàn)

14、，與野生型植株相比，反義抑制BoLH27的表達(dá)對轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)葉片卷曲形成葉球的時期有明顯提前作用，主要表現(xiàn)在反義抑制BoLH27的轉(zhuǎn)基因植株長勢更好，其蓮座期葉片表現(xiàn)出球葉的部分性狀，主要表型為葉片寬大，基部無葉柄，在葉片基部有叢生葉耳，而正義表達(dá)植株和野生型表型差異不顯著。而本實(shí)驗(yàn)中所獲得的BoSF21超量表達(dá)和反義抑制轉(zhuǎn)基因植株出苗物候期時間不一致，且與對照的物候期不一致，未能對BoSF21功能進(jìn)行分析，目前我們已經(jīng)獲得了To代種子，