殼聚糖包裹鹽酸萬古霉素脂質(zhì)體的研究.pdf

1、慢性骨髓炎，一直被醫(yī)學(xué)界認(rèn)為是屈居于癌癥之后的第二大頑疾，臨床常規(guī)的治療方法是徹底清創(chuàng)后連續(xù)大劑量應(yīng)用抗生素治療，由于慢性骨髓炎病程較長，長期頻繁給予比較敏感的抗生素導(dǎo)致耐藥性增加，使得慢性骨髓炎的復(fù)發(fā)率居高不下。鹽酸萬古霉素是第一代糖肽類抗生素，可以通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁中磷脂和多肽的生成干擾細(xì)胞壁的合成，從而抑制細(xì)菌的生長和繁殖，與其他抗生素沒有交叉耐藥性，極少產(chǎn)生耐藥菌株，對大多數(shù)的革蘭氏陽性菌有效，特別是金黃色葡萄球菌。雖然它特異性

2、作用于細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖，但在早期應(yīng)用過程中出現(xiàn)比較明顯的腎毒性、耳毒性以及神經(jīng)肌肉阻滯等副作用。慢性骨髓炎患者免疫力較差，極易導(dǎo)致急性腎損傷以及慢性腎臟疾病。這阻礙了慢性骨髓炎的治療，給臨床藥學(xué)工作者提出了新的研究課題。
　　脂質(zhì)體是一種極具潛力的緩控釋系統(tǒng)，有良好的包封水溶性藥物的能力。由于它的脂質(zhì)雙分子層是由磷脂和膽固醇組成，這兩種成分跟細(xì)胞膜相似，極易與感染的細(xì)菌融合，因此脂質(zhì)體被認(rèn)為是一種無毒性的生物可降解的緩控釋藥物傳

3、遞系統(tǒng)。而運(yùn)用層層靜電沉積的原理，采用滴注法，將帶正電荷的天然多糖殼聚糖包裹在脂質(zhì)體表面，與帶負(fù)電的細(xì)胞膜相互作用，打開上皮細(xì)胞之間的緊密連接，有利于大分子物質(zhì)在上皮組織間的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而增加親水性大分子細(xì)胞旁路的通透性，促進(jìn)親水性大分子藥物的吸收。
　　本課題首先以注射用大豆卵磷脂和膽固醇為載體材料，采用改良的逆相蒸發(fā)法制備了鹽酸萬古霉素脂質(zhì)體;然后采用滴注法制備殼聚糖包裹的鹽酸萬古霉素脂質(zhì)體，并對兩種鹽酸萬古霉素脂質(zhì)體的理化性質(zhì)、

4、體外釋藥性和初步安全性進(jìn)行了研究;最后以鹽酸萬古霉素溶液為對照，對兩種脂質(zhì)體在小鼠體內(nèi)的藥物動力學(xué)及組織分布進(jìn)行了研究，通過藥動學(xué)參數(shù)評價其在小鼠體內(nèi)的緩釋性和靶向性。
　　1.鹽酸萬古霉素脂質(zhì)體的制備與理化性質(zhì)研究
　　建立了HPLC法測定脂質(zhì)體中鹽酸萬古霉素含量的方法，并對方法學(xué)進(jìn)行驗證;建立了超濾離心法測定鹽酸萬古霉素脂質(zhì)體的包封率，并進(jìn)行了方法學(xué)考察。根據(jù)鹽酸萬古霉素的溶解特性，以粒徑和包封率為考察指標(biāo)，選擇改良后的

5、逆相蒸發(fā)法制備鹽酸萬古霉素脂質(zhì)體，并對制備工藝進(jìn)行了系統(tǒng)研究，在單因素考察的基礎(chǔ)上，采用正交試驗設(shè)計，優(yōu)化得到最佳處方組成和制備工藝;采用透射電子顯微鏡觀察其外觀形態(tài)，用激光粒徑和電位分析儀測定粒徑和zeta電位;并對其載藥量、包封率、pH值等理化性質(zhì)進(jìn)行考察，驗證處方組成和制備工藝的可行性。
　　方法學(xué)考察結(jié)果表明:HPLC法測定脂質(zhì)體中鹽酸萬古霉素含量的方法，輔料不干擾藥物的測定，專屬性強(qiáng)，精密度、回收率均符合測定要求。采用超

6、濾離心法測定鹽酸萬古霉素脂質(zhì)體的包封率，方法省時節(jié)能，回收率高，重現(xiàn)性好。采用最佳處方和工藝制備的鹽酸萬古霉素脂質(zhì)體，透射電鏡下觀察呈類球形，大小分布均勻，平均粒徑為188.4±5.22nm，平均Zeta電位為-10.1±4.40 mV，包封率為40.78±1.04％，載藥量為2.55±0.065％，pH值為5.96±0.066，符合注射要求;三批脂質(zhì)體重現(xiàn)性試驗結(jié)果表明，處方組成合理，制備工藝可行。
　　2.殼聚糖包裹的鹽酸萬古

7、霉素脂質(zhì)體的制備與理化性質(zhì)研究
　　采用滴注法制備了殼聚糖包裹的鹽酸萬古霉素脂質(zhì)體，通過考察殼聚糖分子量、殼聚糖用量以及脂質(zhì)體混懸液與殼聚糖體積比對c-VANH-Lip Zeta電位的影響，確定了最佳處方。采用透射電子顯微鏡觀察其外觀形態(tài)，用激光粒徑和電位分析儀測定粒徑和zeta電位;并對其載藥量、包封率、pH值等理化性質(zhì)進(jìn)行考察，驗證處方組成和制備工藝的可行性。
　　結(jié)果表明，采用滴注法成功制備了殼聚糖包裹的鹽酸萬古霉素脂

8、質(zhì)體，透射電鏡下觀察呈類球形，大小分布均勻;按最佳處方和工藝制備的殼聚糖包裹的鹽酸萬古霉素脂質(zhì)體與普通脂質(zhì)體比較，其粒徑略有增加，Zeta電位從荷負(fù)電逐漸轉(zhuǎn)化成荷正電，平均粒徑為220.4±3.56nm，平均Zeta電位為25.7±1.12 mV，包封率為32.65±0.586％，載藥量為2.18±0.039％，平均pH值為4.95±0.082，符合注射要求;三批脂質(zhì)體重現(xiàn)性試驗結(jié)果表明，處方組成合理，制備工藝可行。
　　3.兩種

9、鹽酸萬古霉素脂質(zhì)體的體外釋藥性及初步安全性評價
　　采用動態(tài)膜透析法比較VANH-Lip和c-VANH-Lip兩種鹽酸萬古霉素脂質(zhì)體的體外釋放特性，并對釋放曲線進(jìn)行數(shù)學(xué)模型擬合。另外，采用健康家兔進(jìn)行了體外溶血試驗，初步評價了其安全性。
　　體外釋放結(jié)果表明，相比于鹽酸萬古霉素溶液，兩種鹽酸萬古霉素脂質(zhì)體體外釋藥曲線相似，藥物均表現(xiàn)出一定的緩釋作用，均符合weibull方程。其中c-VANH-Lip釋放相對更緩慢，可能是由于

10、殼聚糖的包裹，降低了脂質(zhì)的暴露程度，從而減少藥物的泄漏，突釋現(xiàn)象明顯降低;增加了c-VANH-Lip膜的厚度，延緩脂質(zhì)體中藥物的釋放。體外溶血試驗中，肉眼觀察兩種脂質(zhì)體均未發(fā)生溶血及凝集現(xiàn)象，表明兩種脂質(zhì)體安全、可靠，可應(yīng)用于靜脈注射。
　　4.小鼠體內(nèi)藥物動力學(xué)及組織分布研究
　　建立了HPLC法測定VANH在小鼠血漿和各組織中濃度的方法，并進(jìn)行方法學(xué)考察;以鹽酸萬古霉素溶液為對照制劑，研究小鼠尾靜脈注射VANH-Lip和

11、c-VANH-Lip后的藥動學(xué)特性和組織分布的差異，計算脂質(zhì)體靶向參數(shù)，評價其組織的靶向性。
　　方法學(xué)考察表明，本部分所建立的HPLC法測定VANH在小鼠血漿和各組織中濃度的方法，能夠滿足生物樣品測定的要求。小鼠體內(nèi)藥物動力學(xué)結(jié)果表明，VANH-Sol組的消除半衰期為1.888h，VANH-Lip組為2.240h，c-VANH-Lip組為3.490h，相比于VANH-Sol組，VANH-Lip組和c-VANH-Lip組的消除半衰

12、期分別延長了0.19和0.85倍;與半衰期相同，VANH-Lip組和c-VANH-Lip組的平均滯留時間(MRT0-∞)比VANH-Sol組分別延長了0.63倍、1.60倍;對于血藥濃度-時間曲線下面積（AUC0-∞），VANH-Sol組為22.490 mg/l·h，VANH-Lip組為44.710 mg/l·h，c-VANH-Lip組為59.908 mg/l·h，VANH-Lip組比VANH-Sol組增大了0.99倍;c-VANH-L

13、ip組比VANH-Sol組和VANH-Lip組分別增大了1.66倍和0.34倍。這說明將鹽酸萬古霉素制成殼聚糖包裹的脂質(zhì)體，延長了VANH的體內(nèi)作用時間，提高了VANH的治療效果。可以通過減少給藥次數(shù)，降低給藥劑量，達(dá)到與鹽酸萬古霉素注射劑相同的治療效果。小鼠體內(nèi)組織分布結(jié)果表明，對于VANH-Lip組，在肝、脾中的Re值分別是2.167和1.982;對于c-VANH-Lip組，在肝、脾中的Re值分別是3.594和1.985，而兩種脂質(zhì)

14、體在腎臟的Re值分別為0.645和0.607。相對于VANH-Sol組，VANH-Lip組和c-VANH-Lip組腎臟的分布明顯降低，這有利于減少VANH在臨床應(yīng)用中出現(xiàn)的腎毒性。
　　綜上，本課題成功構(gòu)建了殼聚糖包裹的鹽酸萬古霉素脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)，制備工藝簡單可靠，重現(xiàn)性好，包封率相對較高，各項理化性質(zhì)均符合靜脈注射要求;體外釋放實驗結(jié)果表明，與鹽酸萬古霉素脂質(zhì)體相比，殼聚糖包裹的鹽酸萬古霉素脂質(zhì)體緩釋作用更強(qiáng);體外溶血實驗結(jié)果表