湖北省水稻白葉枯菌的小種組成及定量檢測體系的建立.pdf

1、水稻白葉枯病曾經(jīng)是我國水稻生產(chǎn)上的“三大病害”之一，后由于抗病品種的推廣應(yīng)用，病害發(fā)生危害得到一定程度的控制。目前，本病在我國不同水稻種植區(qū)，尤其是沿海稻區(qū)仍是影響水稻生產(chǎn)的重要障礙因素。監(jiān)測和掌握發(fā)病地區(qū)白葉枯菌小種毒力分化、群體結(jié)構(gòu)及遺傳變異等，可以對(duì)抗病品種的選育與合理利用作出指引，是控制病害發(fā)生、降低產(chǎn)量損失的有效途徑。
　　本研究對(duì)從湖北省水稻主產(chǎn)區(qū)采集到的白葉枯病標(biāo)樣，并分離得到的71個(gè)白葉枯菌株進(jìn)行了小種鑒定和遺傳多

2、樣性分析。在此基礎(chǔ)上，初步建立了針對(duì)白葉枯菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測體系，對(duì)其特異性和靈敏度進(jìn)行了檢測，并應(yīng)用該體系對(duì)接種白葉枯菌后水稻葉片Xoo菌量變化進(jìn)行了追蹤測定，取得的主要結(jié)果如下。
　　1.對(duì)2013-2014年間于湖北省各地區(qū)采集分離得到的71個(gè)水稻白葉枯菌株利用鑒別寄主法進(jìn)行了小種鑒定，結(jié)果表明有R1、R2、R3、R4、R5、R6、R9這7個(gè)小種。其中優(yōu)勢小種為R3（出現(xiàn)頻率為33.80％）。與前期小種鑒定結(jié)果相比，

3、2007-2009年到2013-2014年，湖北省優(yōu)勢小種從R4變?yōu)镽3，各市優(yōu)勢小種變化較大，武漢市的優(yōu)勢小種仍為R4，但頻率增加了28.0％;孝感市的優(yōu)勢小種由R4、R5、R9變?yōu)镽3、R5;宜昌市的優(yōu)勢小種由R4、R5變?yōu)镽1;黃岡市的優(yōu)勢小種由R3、R4變?yōu)镽3;荊州市的優(yōu)勢小種由R5變?yōu)镽4;咸寧市的優(yōu)勢小種由R3、R5變?yōu)镽3;襄陽市的優(yōu)勢小種由R2、R4變?yōu)镽1。
　　2.對(duì)71個(gè)菌株基因組DNA進(jìn)行Rep-PCR擴(kuò)

4、增，將得到的指紋帶型進(jìn)行聚類分析結(jié)果表明:引物ERIC、BOX分別呈現(xiàn)出16、15種譜型，引物REP的分辨率太低，不能進(jìn)行聚類分析。以彼此帶位相似率70％為界，通過UPGMA聚類分析可將71個(gè)菌株分別引物ERIC、BOX擴(kuò)增譜型分別分為13簇、8簇。然而本次試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)菌株的地理來源、小種和遺傳多樣性之間有顯著相關(guān)性。
　　3.試驗(yàn)還篩選出了高特異性、高靈敏度的引物，建立了對(duì)水稻白葉枯菌實(shí)時(shí)熒光定量檢測體系。在同普通PCR檢測作對(duì)比

5、的試驗(yàn)中，對(duì)菌液、模擬帶菌種子、模擬帶菌土壤的檢測結(jié)果表明，實(shí)時(shí)熒光定量PCR比普通PCR的靈敏度要高10-1000倍，最低可以檢測出濃度為100個(gè)拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒、103cfu/mL的菌液。在模擬帶菌種子和土壤檢測中，均可以檢測到病菌，但實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測靈敏度仍比常規(guī)PCR要高。試驗(yàn)還制作了標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，用來進(jìn)行精確的定量試驗(yàn)，對(duì)人工接種后水稻葉片上Xoo菌量變化進(jìn)行了檢測，找到了水稻顯癥的閾值為10cm長度葉片上Xoo菌量