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文檔簡介
1、水稻白葉枯病是一種由白葉枯病菌引起的細(xì)菌性病害,已嚴(yán)重影響到了水稻的品質(zhì)與產(chǎn)量。克隆抗病基因,培育抗病品種才是經(jīng)濟(jì)有效的防治水稻白葉枯病方法。
本研究克隆了22個(gè)水稻抗白葉枯病相關(guān)基因。其中4個(gè)基因是通過酵母雙雜篩選出的抗病相關(guān)基因,另外18個(gè)基因是對(duì)Y73接種白葉枯病菌后篩選出的抗病相關(guān)基因。Xa5是水稻感病抗病過程中的一個(gè)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)節(jié)點(diǎn);x a5是一個(gè)已知的抗病基因,它的抗病功能是由于其編碼的蛋白與Xa5有一個(gè)氨基酸的差
2、異;OmXa5是疣粒野生稻中Xa5的等位基因,而且它編碼的蛋白與Xa5、xa5均有差異。為了研究這22個(gè)基因的功能及它們與水稻抗白葉枯關(guān)鍵基因Xa5、xa5、OmXa5之間的互作關(guān)系,我們進(jìn)行了一系列的研究。
22個(gè)互作候選基因分別與Xa5、xa5、OmXa5進(jìn)行BiFC(雙分子熒光互補(bǔ))互作鑒定后發(fā)現(xiàn):Xa5與過氧化氫同工酶(Os02g0115700)、類組蛋白(Os05g0461400)互作發(fā)生在細(xì)胞核上,與類泛素蛋白(O
3、s09g0420800)互作同時(shí)發(fā)生在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)膜上,與其余的19個(gè)候選基因互作時(shí)沒有觀察到熒光信號(hào);OmXa5與這22個(gè)候選基因的互作模式和 Xa5相同;xa5與過氧化氫同工酶(Os02g0115700)、類組蛋白(Os05g0461400)互作發(fā)生在細(xì)胞核上,與類泛素蛋白(Os09g0420800)和其余19個(gè)候選基因互作時(shí)沒有觀察到熒光信號(hào),可見xa5與這22個(gè)候選基因的互作模式與Xa5不同。我們推測類泛素蛋白(Os09g04
4、20800)、過氧化氫同工酶(Os02g0115700)、類組蛋白(Os05g0461400)這三個(gè)蛋白可能是水稻抗病相關(guān)途徑中的重要調(diào)控因子;OmXa5的功能與Xa5相似,其突變的氨基酸可能對(duì)蛋白的功能無影響。
利用亞細(xì)胞定位技術(shù)對(duì)22個(gè)互作候選基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了分析,為這些基因的功能研究提供了重要信息。22個(gè)候選基因中5個(gè)基因的sGFP融合蛋白定位于細(xì)胞核上,可能發(fā)揮了轉(zhuǎn)錄因子的功能;5個(gè)基因的s GFP融合蛋白定位于細(xì)
5、胞質(zhì)膜上,推測其功能可能是在細(xì)胞質(zhì)膜上調(diào)控物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn);6個(gè)基因的sGFP融合蛋白同時(shí)定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)膜上;另外還有6個(gè)基因的s GFP融合產(chǎn)物亞細(xì)胞定位時(shí)沒有觀察到熒光定位信號(hào)。
在進(jìn)行互作鑒定及亞細(xì)胞定位觀察時(shí),我們采用的是快速靈活的Gate way重組技術(shù)。但在構(gòu)建入門載體時(shí)較低的線性化效率和連接效應(yīng)影響了實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展。于是我們對(duì)現(xiàn)有的入門載體構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)行改進(jìn),用內(nèi)切酶BciVI來線性化入門載體。BciVI線性化載體的效率
6、要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于XcmI,且在測試實(shí)驗(yàn)中用BciVI線性化的T載體連接基因片段后陽性克隆數(shù)也比XcmI多出大約40%。長度在2000 bp內(nèi)的PCR片段都可以高效的連接到BciVI線性化后的T載體(大約50%的克隆中目的基因片段都以期望的方向連入了入門載體)。隨著片段長度的增加克隆數(shù)和克隆陽性率雖有下降,但最大仍可連入長度為4700 bp的基因片段。改進(jìn)后的入門載體構(gòu)建方法具有穩(wěn)定高效的特點(diǎn),將來可以用來更加高效的構(gòu)建Gate way入門載體
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